Soutenance de thèse de Sara BELLALI

Le microbiote intestinal humain abrite un grand nombre de micro-organismes qui jouent un rôle crucial dans la santé humaine. Étant donné la faible concentration d'oxygène dans l'intestin humain, cet écosystème complexe est dominé par des bactéries sensibles à l'oxygène. L'approche métagénomique et la culture microbienne sont les principales méthodes utilisées pour explorer le microbiote intestinal humain. Cependant, une grande discordance a été observée entre ces techniques, révélant que la majorité des bactéries intestinales restent inexplorées. De plus, le nombre de bactéries détectées par des méthodes quantitatives indépendantes de la culture (p. ex. microscopie, cytométrie en flux, etc.) s'est révélé beaucoup plus élevé que celui des bactéries cultivées sur des géloses. Cet écart est connu sous le nom de la « Great plate count anomaly ». Pour surmonter ces problèmes, les progrès récents des techniques de culture, y compris la « microbial culturomics », ont permis de cultiver avec succès de nombreuses bactéries qui n'étaient pas cultivées auparavant. Cependant, nous sommes encore loin d'avoir décrits tous les microbes. L'objectif principal de ce travail était d'expliquer ''l’incultivabilité" des bactéries intestinales et de maintenir leur viabilité. Tout d'abord, nous avons étudié l'effet de l'oxygène atmosphérique sur la viabilité et la cultivabilité des bactéries. Deuxièmement, nous avons appliqué une nouvelle approche combinant l'analyse métagénomique, la culturomics et la technique de cytométrie en flux afin d'explorer la diversité des bactéries intestinales vivantes et mortes à partir de 8 échantillons fécaux. Troisièmement, nous avons réussi à créer un nouveau milieu protecteur qui préserve le microbiote fécal pendant la congélation et la lyophilisation. Dans ce travail, nous avons constaté que l'exposition à l'oxygène pendant plus d'une heure réduisait la cultivabilité des bactéries à 50%. En parallèle, en présence d'antioxydants, les bactéries cultivées ont atteint un rendement de 67%. De plus, lorsque les échantillons ont été exposés à l'oxygène pendant moins de 2 minutes, la cultivabilité a augmenté à 87%. Ce dernier résultat suggère que la non-cultivabilité pourrait être due au fait que les bactéries sensibles à l'oxygène étaient à l'état viable mais non cultivable, ou qu'elles étaient blessées ou mortes. Ce résultat a été confirmé lorsque nous avons séquencé les bactéries vivantes, blessées et mortes triées par le FACS. 28 % des UTOs correspondaient à des bactéries mortes, dont environ deux tiers étaient inconnues, et la majorité de ces bactéries étaient sensibles à l’oxygène. L’approche culturomics a généré un total de 495 bactéries, dont 103 grâce à l’utilisation des nouveaux milieux de cultures. La culturomics nous a ainsi permis d'isoler 8 nouvelles espèces dont 4 ont été décrites dans ce travail. D'autre part, notre nouveau milieu protecteur a démontré son efficacité sur les échantillons fécaux et les bactéries sensibles à l'oxygène telles que Akkermansia muciniphila, Methanobrevibacter smithii et Faecalibacterium prausnitzii. La viabilité bactérienne après lyophilisation avec ce milieu protecteur était comprise entre 85% et 93%. D'autres études seront nécessaires pour tester la transplantation de microbiote fécal via l’ingestion par voie orale de gélules contenant des selles lyophilisées. Ce nouveau mode d’administration est moins invasif et plus tolérable pour les patients. En conclusion, nos travaux ont confirmé l'importance du conditionnement des échantillons en anaérobie et l’élaboration de meilleures conditions de culture afin d’obtenir de meilleurs taux d'isolement. De plus, notre étude nous a permis d’explorer la « dark matter » du microbiote intestinal humain et a révélé que la métagénomique et l'approche culturomics sont nécessaires pour bien comprendre la diversité et la richesse des bactéries cultivables et non cultivables.

The human gut microbiota harbors a wide range of microorganisms that play a crucial role in human health. Given the low oxygen level in the human gut, this complex ecosystem is dominated by oxygen-sensitive bacteria. Metagenomics approach and microbial culture are the main method used to explore the human gut microbiota. However, a large discordance was observed between these techniques revealing that the majority of gut bacteria remain unexplored. In addition, the number of bacterial cells detected by quantitative culture-independent methods (e.g. microscopy, flow cytometry…etc.) was found to be much higher compared to that of cultured bacteria on agar plates. That discrepancy is known as the “ Great plate count anomaly ”. To overcome these problems, recent advances in culture techniques including the microbial culturomics have successfully cultured many previously uncultured bacteria. However, we are still far from having described all the microbes. The main goal of this work was to investigate the “ unculturability ” of gut bacteria and maintain their viability. Firstly, we studied the effect of atmospheric oxygen on bacterial viability and culturability. Secondly, we applied a new approach combining the metagenomics analysis, microbial culturomics and flow cytometry technique in order to explore the known and unknown richness of live and dead gut bacteria from 8 fecal samples. Among the conditions tested in microbial culturomics, we used 17 new additional culture conditions to enhance the culturability of anaerobic bacteria. Thirdly, we successfully produced a new protectant medium preserving fecal microbiota during freezing and freeze-drying. In parallel, we found that exposure to oxygen for more than 1 hour decreased the culturability of bacteria to 50%. Meanwhile, in the presence of antioxidants, cultured bacteria reached a 67% yield. More importantly, when samples were exposed to oxygen for less than 2 min, the culturability increased to 87%. This result suggested that the non-culturability might be due to the fact that oxygen-sensitive cells were in the viable but non-culturable state, or either injured or dead. This funding was confirmed when we sequenced the FACS sorted live, injured and dead bacteria, where, 28% of of bacterial OTUs in total fecal samples were exclusively found dead and/or injured. Among these non-live bacteria, about two-thirds were unknown, thus a large amount were anaerobic. The microbial culturomics using the new media yield a total of 345 bacteria of which 103 bacteria were not found by the 18 standard culturomics conditions. The culturomics approach allowed us to isolates 8 new species out of which 4 has been described in this work. In the other hand, our new protectant medium showed its effectiveness on fecal samples and oxygen sensitive bacteria such as Akkermansia muciniphila, Methanobrevibacter smithii and Faecalibacterium prausnitzii, where bacterial viability after freeze-drying was ranged between 85% and 93%. Further studies will be done to test freeze-dried microbiota transplantation in oral capsules using this protectant medium, a far gentler and esthetically pleasing format that could be self-administrated. In conclusion, our work has confirmed the importance of sample conditioning and processing to obtain the best culture conditions and isolation rates. In addition, our study allowed us to shed light on the dark matter of the human gut microbiota and revealed that both metagenomics and culturomics approach are needed for full insight into the diversity and richness of culturable and unculturable bacteria in the human gut microbiota.