Soutenance de thèse de Valentina CURCIO

La microscopie de fluorescence polarisée est une technique très puissante pour l’étude de l’organisation de structures biologiques à l’échelle moléculaire. Si les fluorophores sont rigidement liés aux protéines d’intérêt, la mesure de leur orientation, ainsi que leur localisation, peut rendre compte de l’organisation des protéines et de changements conformationnels à l’échelle nanométrique. Les propriétés d’orientation comprennent l’orientation moyenne, ainsi que les fluctuations moléculaires (wobbling), moyennées sur le temps d’acquisition des images (30-100ms). Certaines techniques récentes sont capables de réaliser des images de super-résolution à molécule unique, comme par exemple le PALM ou le STORM, de manière polarisée, ce qui rajoute l’information sur l’orientation et le wobbling des molécules uniques à la localisation mesurée avec une précision nanométrique. Souvent, par contre, la mesure de l’orientation est limitée à la projection 2D de la polarisation sur le plan de l’échantillon, ce qui cause des biais dans la mesure du wobbling. Dans ma thèse, j’ai analysé ces biais, et proposé une solution pour les réduire, en baissant l’ouverture numérique de détection, ce qui s’est montré efficace par les résultats théoriques et expérimentaux obtenus. J’ai ensuite adressé le défi de la mesure de l’orientation et wobbling d’émetteurs fluorescents uniques en 3D, ainsi que leur position 2D, pour l’imagerie super-résolue à molécule unique. J’ai poursuivi cet objectif en développant deux techniques de microscopie polarisée, utilisant deux approches différentes : la première se base sur la séparation du plan image en quatre projections de polarisation différentes, et la sensibilité à l’orientation 3D est assurée par un filtrage d’intensité dans le plan focal arrière de l’objectif. En utilisant la démarche des problèmes inverses, on peut déterminer de façon robuste et rapide l’orientation 3D d’émetteurs uniques dans chacune des quatre images polarisées et filtrées en intensité. Cette approche est compatible avec les techniques de super-résolution à molécule unique, y compris les approches de localisation 3D, grâce au fait que la forme des PSFs n’est pas modifiée. L’autre approche, développée en collaboration avec M. Alonso, est basée sur la manipulation de la phase et polarisation du plan focal arrière de détection avec en élément optique à biréfringence spatialement variable. Les modifications de la forme des PSFs induites par cet élément optique dépendent de manière non-ambiguë de l’orientation 3D et du wobbling des fluorophores, ainsi que de leur position en z, qui peut être mesurée avec une précision de quelques dizaines de nanomètres. Il est ainsi possible de mesurer à la fois l’orientation et le wobbling 3D, ainsi que la position 3D des molécules. Nous avons appliqué les deux techniques à l’étude des propriétés structurelles de filaments d’actine marqués en fluorescence et à l’étude des fibres de stress d’actine en cellules fixées.

Fluorescence polarization microscopy is a very powerful technique to study the organization of biological structures at the molecular scale. Providing that the fluorophores are rigidly linked to the proteins of interest, the measurement of orientational behaviour of single fluorophores, in addition to their localization, can report protein organization and conformational changes at the nanoscale. Orientational properties encompass both mean orientation and orientational fluctuations extent (wobbling) averaged over the time scale of the image recording (30-100ms). Recent techniques are able to perform single molecule super-resolution imaging techniques such as PALM or STORM in a polarized way, adding thus the orientational information of the single molecules, other than their localization with nanometer precision. Often, though, the retrieval of the orientation is limited to the 2D projection of the polarization direction on the sample plane, which causes biases in the retrieval of the molecular wobbling. In this thesis I have analyzed these biases, and proposed a way to reduce them by lowering the detection numerical aperture, which has proven to be a valuable way both by simulations and experimental results. I have then addressed the challenge of measuring the full 3D orientational properties of single fluorescent emitters, as well as their 2D position, for single molecule super-resolution imaging techniques. I addressed this challenge with the development of two polarized microscopy techniques with two different approaches: the first one is based on the splitting of the image plane in four distinct polarization projections, and the sensitivity to the 3D orientation is assured by adequate intensity filtering in the back focal plane. Using an inverse problem approach, from the relative intensity of the single emitters in each of the four split-polarized intensity-filtered images, we can determine their 3D orientation, wobbling and 2D position in a fast and robust way. This approach is compatible with single molecule super-resolution techniques, including 3D localization approaches, due to the fact that it doesn’t modify the shape of the PSFs. The other approach, developed in collaboration with M. Alonso, is based on the manipulation of the phase and polarization in the detection back focal plane with a spatially-varying birefringent optical element. The induced modifications of the PSFs shape depend in an unambiguous way on the 3D angular orientation and wobbling of single molecules, and on their z position, which can be measured with a precision of a few tens of nm. It is thus possible to measure the 3D orientation, wobbling and 3D position of single molecules at the same time. We applied both techniques to the study of structural properties of fluorescently labelled F-actin filaments and actin stress fibers in fixed cells.