Soutenance de thèse de Coralie VALLE

L’ordre des Mononegavirales regroupe des virus hautement pathogènes pour l’Homme tels que les virus de la rougeole, de la rage ou encore Ebola. Leur génome code pour une protéine L (« Large ») qui joue un rôle déterminant dans les étapes de transcription et réplication virale. La protéine L catalyse également la synthèse de la structure coiffe. Cette structure chimique est constituée d’une guanosine liée au premier nucléotide de l’extrémité 5’ de l’ARNm par une liaison 5’-5’ triphosphate. L’extrémité C-terminale de la protéine L porte des activités méthyltransférases (MTases) responsables des méthylations en position 2’O du premier nucléotide de l’ARN et en N7 de la structure coiffe. Ces méthylations de la coiffe jouent un rôle clef pour la réplication virale dans la mesure où elles permettent la traduction des ARNm viraux en protéines tout en empêchant leur détection par les senseurs de l’immunité innée tels que RIG-I, MDA5 ou les protéines IFITs. Le domaine MTase est suivi d’un domaine C-terminal (CTD) de fonction inconnue à ce jour. L’objectif de ce projet de recherche a été d’étudier le mécanisme de coiffage chez les Mononegavirales, prenant pour modèle le virus de la rage et le virus Ebola. Une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de caractériser la fonction MTase de la protéine L du virus Sudan ebolavirus (SUDV). En plus de ses activités MTases sur la coiffe (2’O et N7 MTases), le domaine MTase+CTD de SUDV catalyse des modifications épi-transcriptomiques sur les ARNs viraux en méthylant en 2'O des adénosines internes aux séquences d’ARN. Bien que des modifications similaires aient été identifiées chez plusieurs virus, le rôle de telles modifications reste peu documenté. Dans ce projet, nous avons analysé le rôle du domaine CTD dans la régulation des activités MTases de SUDV et le recrutement de l’ARN. Il a été montré que le domaine CTD joue un rôle crucial dans le recrutement de l’ARN, et donc indispensable pour les activités MTases, ouvrant la voie vers le développement de nouvelles thérapies antivirales. Par une étude de mutagénèse dirigée nous avons mis en évidence que certains résidus des domaines MTase et CTD modulent spécifiquement les différentes activités MTases de SUDV. Des résidus dans le sillon de liaison à l'ARN à l’interface entre les domaines MTase et CTD et découplant les différentes activités MTases ont été identifiés. De plus, la structure cristallographique du domaine MTase de SUDV en complexe avec un VHH a été résolue à 1.8 Å. Les résidus catalytiques de SUDV MTase sont exposés à la surface de la structure dépourvue site apparent de liaison à l'ARN, confirmant le rôle du CTD dans le recrutement du substrat. L’ensemble de ces résultats contribue donc à une meilleure compréhension de l’activité MTase de la L de SUDV, un acteur central dans la réplication virale et l’échappement à la réponse immunitaire innée de l’hôte, qui pourra servir de cible pour le développement de futures molécules antivirales.

Viruses belonging to the order Mononegavirales represent a wide variety of pathogens for humans such as measles virus, rabies virus and Ebola virus. Their genome codes for a large (L) protein which plays an important role in viral transcription and replication. The L protein catalyzes the synthesis of cap structure. This chemical structure consists in a guanosine linked to the first nucleotide of the 5 ’end of the mRNA by a 5’-5’ triphosphate bond. The C-terminus of L protein carries methyltransferase activity (MTase) responsible to methylation of 2’O position of N1 ribose and N7 of guanosine. These methylations of cap structure play a key role in viral replication, insofar as they allow viral translation while preventing their detection by host immune sensor such as MDA5, RIG-I and IFIT. The MTase is followed by a C-terminal domain (CTD) of unknow function. The aim of this research project is to study the capping mechanism of Mononegavirales using rabies virus and Ebola virus as models. A recent study carried out in the laboratory lead to characterize the MTase function of the L protein of Sudan ebolavirus (SUDV). Surprisingly, SUDV MTase, in addition to its conventional MTase activity (2’O and N7 MTase), also catalyzes also catalyses internal adenosine 2'-O methylation. Although similar modifications have been identified in several viruses, the role of such modifications remains poorly understood. In this project, we addressed the question of the role of the CTD domain in the regulation of SUDV MTase activities and the recruitment of RNA. The CTD domain has been shown to play a crucial role in the recruitment of RNA, and in turn regulates the different MTase activities, paving the way for the development of new antiviral therapies. By mutagenesis studies, we have demonstrated that the mutation of residues on the MTase and CTD domains specifically modulates the different SUDV MTase activities. In addition, we were able to identify residues in the RNA binding groove, at the interface between the MTase and CTD, decoupling the different MTase activities. The crystallographic structure of the MTase domain of SUDV in complex with a nanobody was also resolved at 1.8 Å. The catalytic residues of SUDV MTase are exposed on the surface of the structure lacking an apparent RNA binding site, confirming the role of CTD in the recruitment of the substrate. All of these results contribute to a better understanding of the MTase activity of SUDV L protein, a central actor in viral replication and the escape to the innate immune response of the host, and could serve as a basis for the development of future antiviral molecules.