Soutenance de thèse de Nicolas GOMEZ

Les métaux biologiques, et notamment le Fe, Zn, Ni, Cu, Co, et Mn, sont nécessaires pour la croissance et la suivie de tous les organismes vivants. La fonction des métaux biologique repose sur leur utilisation pour des fonctions structurales et/ou catalytiques par des protéines incluses dans des voies métaboliques essentielles. L'acquisition de métaux à partir de l'environnement est donc essentiel aux bactéries et ces voies doivent être adaptables et finement régulées pour permettre aux bactéries de s'adapter dans des niches écologiques diverses. C'est particulièrement le cas pour les bactéries pathogènes, l'hôte mettant en place des stratégies de défenses visant à restreindre la biodisponibilité des métaux dans un processus immunologique nommé immunité nutritionnelle. Dans ces conditions de carences extrêmes, une stratégie évolutivement conservée chez les pathogènes est la biosynthèse de petites molécules avec une affinité exceptionnelle pour les métaux nommé métallophores, leur sécrétion dans le milieu environnant, et la réabsorption d'un complexe métal-métallophore par des récepteurs spécifiques dédiés. Durant ma thèse, j'ai contribué à la découverte d'une nouvelle voie d'import des métaux médiée par un métallophore jusqu'alors inconnu. Les gènes cnt (PA4837-4837) de Pseudomonas aeruginosa sont inclus dans un opéron de quatre gènes impliqué dans la biosynthèse (cntL & cntM), export au travers de la membrane interne (MI, cntI) et récepteur de membrane externe (ME, cntO), d'un métallophore proche de la nicotianamine que nous avons nommé pseudopaline. L'expression de cet opéron est régulé in vivo par le Zn via le répresseur Zur (Lhospice*, Gomez*, Ouerdane* et al., Scientific reports, 2017). Cependant, plusieurs partenaires de cette machinerie ne sont pas inclus dans cet opéron: (i) une machinerie permettant la sécrétion de pseudopaline au travers de la ME, (ii) une machinerie permettant la rupture du complexe métal-pseudopaline après son internalisation et (iii) une machinerie permettant l'import de ce complexe au travers de la MI. J'ai d'abord concentré mes efforts sur la compréhension de la mécanistique moléculaire permettant la sécrétion de pseudopaline, et nous avons déterminé que la pseudopaline est sécrétée en deux étapes. La première étape de passage au travers de la MI assuré par CntI, et la deuxième étape de passage au travers de la ME est assuré par la pompe d'efflux MexAB couplée à OprM, une protéine de la famille des TolC (Gomez et al., (1) en préparation). Quand le complexe métal-pseudopaline est importé dans le périplasme après avoir été reconnu par le récepteur CntO, nous montrons que le complexe est modifié par un mécanisme encore inconnu, permettant probablement la libération du métal. Enfin, nous avons constaté que la machinerie pseudopaline est liée à l'activité exprotease. Notamment, IMPa, un facteur de virulence avec un effet immunomodulateur, bénéficie du Zn acquis par la machinerie pseudopaline, expliquant possiblement l’importance de cette machinerie pour la pathogénicité de P. aeruginosa. (Gomez et al., (2) en préparation).

Biological metal ions, including Fe, Zn, Ni, Cu, Co and Mn, are necessary for the growth and survival of all organisms. Metals’ biological functions rely on both catalytic and structural roles of proteins involved in vital metabolic processes. Metal uptake from the environment is, therefore, essential to bacteria, and needs to be adaptable and finely tuned to accommodate various ecological niches. This is particularly true for pathogens, the host having defence strategies aiming at restraining metal’s bio-availability in a process called nutritional immunity. In these circumstances, a shared strategy between pathogens is the biosynthesis of small molecules with an outstanding affinity for metals called metallophores, their secretion in the extracellular space, and the recovery of a metal complexed metallophore through dedicated membrane transporters. During my PhD, I contributed to the discovery of a new metal uptake pathway mediated by a previously unknown metallophore. The cnt genes (PA4834-4837) are encoded in a four-gene operon in Pseudomonas aeruginosa involved in the biosynthesis (cntL and cntM), inner membrane export (cntI) and outer membrane recovery (cntO) of a nicotianamine-like metallophore that we named pseudopaline. The expressions of these genes are regulated in vivo by zinc through the repressor Zur (Lhospice*, Gomez*, Ouerdane* et al. 2017). However, several other partners of the pseudopaline cycle were missing: (i) a machinery for pseudopaline secretion through the OM, (ii) a machinery for metal release from the metallophore, and (iii) an IM import machinery for the complex to be translocated. I further focused on the mechanisms enabling the secretion of pseudopaline, and determined that pseudopaline’s two steps secretion relies on CntI for IM export and the efflux pump MexAB, as well as the TolC-like protein OprM, for the crossing of the OM (Gomez et al (1), in preparation). When retrieved from the extracellular space through CntO, we showed that the loaded metallophore is modified by an unknown mechanism, conceivably allowing metal release. Lastly, we identified that the maturation of several exo-proteases of P. aeruginosa’s relies on pseudopaline zinc import, and IMPa, a virulence factor with an immuno-modulator function, directly benefit from zinc acquired by pseudopaline function (Gomez et al (2), in preparation), thus constituting a possible explanation to the important role of this metal uptake pathway during infection.