Soutenance de thèse de Merlin SANICAS

Les anticorps sont devenus une pierre angulaire de l'immunothérapie pour un large éventail de maladies telles que les maladies infectieuses, auto-immunes et le cancer. Cela est dû à leur haute spécificité et à leur capacité à recruter et à activer les cellules immunitaires pour neutraliser la cible. Les nanobodies (Nbs), correspondant au domaine variable d'une classe spéciale d'anticorps présents chez les camélidés, sont de plus en plus utilisés pour générer des thérapies à base d'anticorps. En pratique, la sélection in vitro de nanobodies, réalisée par expression à la surface de phage ou levure, est dictée par leur affinité pour un antigène en solution ou sur des cibles de surface cellulaire, à l'aide de banques préparées par immunisation ou de banques synthétiques. Bien qu'efficaces pour isoler des molécules de haute affinité, ces méthodes de sélection in vitro ignorent essentiellement le concept de forces mécaniques, dont il a récemment été démontré qu'elles jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus immunologiques impliquant des cellules B, des cellules T et des cellules présentatrices d'antigènes, ou des cellules NK impliqués dans la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), un mode d'action important des anticorps thérapeutiques. Nous avons émis l'hypothèse que l'établissement d'une méthode de sélection reposant sur une application contrôlée des forces mécaniques pourrait générer des nanobodies se comportant de manière optimale au sein de la synapse immunitaire, une structure contrôlant l'activation des cellules immunitaires et soumise à de nombreuses forces mécaniques résultant de la réorganisation du cytosquelette cellulaire. Nous avons ainsi généré une nouvelle méthode de sélection de levure utilisant la microfluidique et reposant sur le principe de la chambre à flux laminaire (LFC). Pour caractériser ce dispositif, nous avons produit des levures qui expriment des Nb connus : deux qui se lient au récepteur CD16a et un qui se lie au facteur de virulence Nef du VIH. Nous avons utilisé un canal microfluidique disponible dans le commerce ainsi qu’un canal de poly diméthylsiloxane (PDMS) original conçu et réalisé au laboratoire. Nos résultats montrent que les levures exprimant Nb adhèrent plus fortement dans un canal microfluidique contenant l'antigène apparenté par rapport à un canal recouvert d'un antigène non pertinent. Les facteurs influençant cette adhérence étaient la période d'incubation avant l'application du flux, le débit, la concentration d'antigène sur la surface du canal et le milieu liquide utilisé. Nous avons ensuite effectué des expériences d'enrichissement à l'aide de plusieurs canaux microfluidiques PDMS sur mesure en utilisant divers ratios de levure liant Nef et de levure liant CD16a. L'injection de ces mélanges dans le canal a conduit à l'enrichissement en levures spécifiques de l'antigène, suivi en temps réel par microscopie à fluorescence in situ, et confirmé ultérieurement par cytométrie en flux. De plus, nous proposons un modèle de prédiction théorique de l'enrichissement fonction du ratio d'adhésion positif / négatif, du ratio de mélange et de la fraction d'expression à la surface de la levure, montrant un bon accord avec l'enrichissement mesuré par cytométrie en flux. A notre connaissance, ce travail fournit la première preuve de la capture spécifique de levures présentant des Nbs en présence de forces contrôlées et de l'enrichissement d'un mélange modèle après 1 tour de sélection en flux. Cette méthode de sélection reposant sur l'écoulement hydrodynamique peut être utilisée pour isoler de nouveaux Nb non seulement en fonction de leur affinité, mais également de leur capacité à résister à la force appliquée. De telles molécules pourraient avoir un potentiel pour la conception future de molécules immunomodulatrices optimisées.

Antibodies have become a cornerstone in immunotherapeutics for a wide array of diseases such as infectious, autoimmune and cancer. This is due to their specificity to their cognate antigens and their ability to recruit and activate other cells needed for a strong immune response to neutralize the target. Nanobodies (Nbs), corresponding the variable domain of a special class of antibodies found in Camelids are being increasingly used to generate antibody-based therapeutics. In practice, the in vitro selection of nanobodies, performed by phage or yeast display, is dictated by their affinity to a cognate antigen in solution or on cell surface targets, using libraries prepared through animal immunization, or synthetic libraries. Although efficient at isolating high affinity binders, these well-established in vitro selection methods essentially ignore the concept of mechanical forces, that has been recently shown to play essential roles in many immunological processes involving B cells, T cells and antigen presenting cells, or NK cells known to be involved in the antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC), an important mode of action of therapeutic antibodies. We hypothesized that establishing a selection method relying on a precisely controlled application of mechanical forces might generate nanobodies behaving optimally within the immune synapse, a structure controlling the activation of immune cells and subject to many mechanical forces resulting from cell cytoskeleton reorganization. We thus generated a new microfluidics-based yeast display selection relying on the laminar flow chamber (LFC) principle. To characterize this device, we produced yeasts that express known Nbs: two that bind to low affinity Fc γ receptor III (Fc γIIIRa or CD16a) and one that binds to the Nef virulence factor of HIV through homologous recombination and yeast transformation. We used a commercially available microfluidic channel and custom-made poly dimethyl siloxane (PDMS) channel coated with the corresponding antigens. Our results show that the Nb-expressing yeasts were adhering more strongly in a microfluidic channel containing the cognate antigen relative to a channel coated with an irrelevant antigen. Factors that influenced this adhesion behavior were incubation period prior to application of flow, flow rate, antigen concentration on the channel surface and the liquid media used. We then performed enrichment experiments using several custom-made PDMS microfluidic channels using various ratios of Nef-binding yeast and CD16a-binding ones. Flowing these mixtures in a channel containing the cognate antigen led to the enrichment of antigen-specific yeasts, monitored in real time by in situ fluorescence microscopy, and confirmed later by flow cytometry. In addition, we derived a theoretical prediction model of the enrichment as a function of positive-to-negative adhesion ratio, mixture ratio and expression fraction in yeast, showing a fair agreement with the enrichment measured by flow cytometry. To our knowledge, this work provides the initial evidence of Nb-specific capture of yeasts under force and the enrichment of a model mixture after 1 round of flow-based selection. This selection method relying on hydrodynamic flow may be used to isolate new Nbs not only based on their affinity, but also in their capability to withstand applied force. Such binders might have a potential for the future design of optimized immune cell engagers.