Soutenance de thèse de Ana Victoria GUTIERREZ PERAZA

Mycobacterium abscessus est une espèce mycobactérienne particulièrement réfractaire à l’antibiothérapie classique et peut causer des infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients atteints de mucoviscidose. Les mycobactéries contiennent de nombreux gènes codant des protéines de la famille des MmpL (Mycobacterial Membrane Protein Large), agissant comme transporteurs de lipides. Le complexe MmpS4-MmpL4a-MmpL4b intervient notamment dans le transport des glycopeptidolipides (GPL) à travers la membrane plasmique. M. abscessus peut présenter deux morphotypes bien distincts : lisse (S) en présence de GPL à la surface de la bactérie ou rugueux (R) en l'absence de GPL. En plus du transport des lipides, les protéines MmpL peuvent également assurer le transport d'une grande variété de substrats, y compris des antibiotiques, et peuvent également participer dans la virulence chez les mycobactéries pathogènes. Par conséquent, ils peuvent être considérées comme une cible thérapeutique prometteuse à exploiter. Les travaux de cette thèse ont principalement porté sur la contribution des MmpL dans la transition d’un morphotype S vers un morphotype R ainsi que dans les mécanismes de résistance à certains antibiotiques chez M. abscessus. Nous nous sommes concentrés également sur le développement de nouveaux outils génétiques permettant une manipulation facilitée au niveau du génome de M. abscessus, notamment pour la création de mutants grâce à des événements de recombinaison homologue simple et double. Le système développé est basé sur la présence d’un marqueur de fluorescence rouge (tdTomato) qui permet une sélection des clones positifs ayant subi la recombinaison homologue. Les gènes mmpSL4ab ont été utilisé pour valider ces techniques, du fait de leur participation dans transport des GPL. Notre méthode nous a permis d'inactiver mmpL4a dans le variant S, ce qui coïncide avec un changement vers un morphotype R et à la perte des GPL. Cette transition phénotypique ayant lieu chez l’hôte infecté, nous avons décrit l'hétérogénéité S/R de plusieurs isolats cliniques issus de deux patients atteints de mucoviscidose et co-infectés par les deux variants. Le séquençage complet des génomes de ces souches a permis l’identification de nouvelles mutations dans le locus GPL qui pourraient être impliqués dans la conversion de S en R. Des travaux antérieurs ont montré la contribution de la pompe à efflux MmpS5/MmpL5 de M. abscessus dans la résistance aux analogues du thiacétazone. Nous avons ensuite élucidé les mécanismes de résistance qui impliquent le régulateur de transcription TetR (MAB_4384) dans l’expression MmpS5/MmpL5. En raison de l'extrême difficulté à traiter M. abscessus, de nouvelles alternatives thérapeutiques ont récemment été proposées, incluant notamment la clofazimine et la bedaquiline. Nos études ont consisté à décrire les mécanismes de résistance à ces antibiotiques chez M. abscessus et d'identifier les mutations et leur impact au niveau d'un autre régulateur transcriptionnel de la famille TetR (MAB_2299c). Nos données génétiques et biochimiques démontrent que les mutations affectant MAB_2299c sont associées à une surexpression accrue de deux pompes à efflux distinctes : MAB_2300-2301 et MAB_1135c-1134c, qui toutes deux contribuent dans la résistance intrinsèque de M. abscessus à la clofazimine et à la bédaquiline. MAB_2299c pourrait donc représenter un nouveau marqueur de résistance à ces deux antibiotiques dans les isolats cliniques. La technique d'inactivation génique que nous avons développé représente un outil performant pour générer très facilement et efficacement des mutants non marqués, avec la possibilité de déléter plusieurs gènes dans la même souche. Ainsi, cette approche pourrait permettre de valider de nouvelles cibles médicamenteuses et/ou facteur de virulence non seulement M. abscessus mais également chez d'autres mycobactéries non tuberculeuses.

Mycobacterium abscessus has recently emerged as one of the most difficult-to-manage Non-Tuberculous mycobacteria (NTM), causing severe pulmonary infections, especially in cystic fibrosis patients. Mycobacteria contain several genes encoding proteins belonging to the mycobacterial membrane protein large (MmpL) family, acting as lipid transporters and proposed to work as efflux pumps. The MmpS4-MmpL4a-MmpL4b complex mediates the biosynthesis/transport of glycopeptidolipids (GPL) across the plasma membrane. M. abscessus exhibits either a smooth (S) morphotype when GPL are associated at the bacterial surface or a rough (R) morphotype when GPL are lacking. In addition to lipid transport, MmpL proteins can mediate the transport of a wide panel of substrates, including drugs, and can also be considered as important virulence factors in pathogenic mycobacteria. Therefore, they can be viewed as a promising drug targets to be further exploited against M. abscessus. The research conducted during this thesis focused mainly in the contribution of MmpL in the S-to-R transition and in drug resistance mechanisms. We focused also on the development of genetic tools that allow to easily manipulate the M. abscessus genome, particularly to generate mutants, based on a single and double homologous recombination events. The system comprises a red fluorescence marker (tdTomato) that simplifies the selection of the positive clones that have undergone gene disruption. The mmpSL4ab gene cluster was used to validate these techniques due to their participation in production/transport of GPL. Using this method, inactivation of mmpL4a in the S variant was associated with a switch to the R morphotype and absence of GPL production. Since the S-to-R transition has been proposed to occur within the host, we next described the heterogeneity of isolates from two cystic fibrosis patients pulmonary co-infected with both morphotypes using whole genome sequencing. This allowed to identified new single nucleotide polymorphism in the GPL locus which may be involved in the S-to-R conversion. Previous work reported the contribution of the M. abscessus MmpS5/MmpL5 efflux pump system in resistance to thiacetazone analogues. Herein, we further elucidated the mechanism of resistances involving the TetR transcriptional regulator (MAB_4384) in the regulation of this efflux pump. Due to the extreme difficulty encountered in the treatment of M. abscessus, alternative therapeutic options have recently been proposed, including for instance the use clofazimine and bedaquiline in current treatments. Our work was aimed at describing the mechanisms of resistance to these drugs and identified mutations in a putative TetR transcriptional regulator (MAB_2299c). Genetic and biochemical approaches demonstrated that mutations in this regulator were associated with increased expression of two efflux pump systems, MAB_2300-2301 and MAB_1135c-1134c, both contributing to the intrinsic resistance level of M. abscessus to clofazimine and bedaquiline. Therefore, MAB_2299c may represent a useful marker of clofazimine and bedaquiline resistance in clinical isolates. The double crossing-over gene inactivation technique developed during these studies represent a powerful tool to easily and efficiently generate unmarked mutants and offers the possibility of delete multiple genes in the same strain. It opens the way to future studies aimed at validating novel drug targets and/or virulence genes not only in M. abscessus but perhaps also in other NTM.