Soutenance de thèse de Serena CORTI

Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) constituent une avancée décisive pour la science biomédicale, car elles peuvent générer un nombre illimité de cellules somatiques pour la modélisation de maladies, le criblage de médicaments et la thérapie cellulaire (TC). La différentiation de neurones dopaminergiques (DA) à partir d’hiPSC apparait comme une alternative prometteuse à l’utilisation des hESC ou du tissu fœtal pour la TC dans la maladie de Parkinson (MP). Les hiPSC peuvent être différenciées in vitro en neurones DA qui survivent et s'intègrent à la structure de l'hôte, en permettant une récupération fonctionnelle si transplantés dans des modèles de la MP. Néanmoins, les protocoles de différenciation ne sont pas encore optimisés: l'efficacité varie, produisant des neurones issus d'un mélange de différentes lignées, et des SC non différenciés peuvent provoquer une tumeur lors d'une transplantation. J'ai étudié la possibilité d'augmenter la différenciation d’hiPSC en neurones DA in vitro et in vivo, en modulant la perception de la signalisation cellulaire, par la régulation négative de Glypican4 (GPC4). C’est un héparan-sulfate protéoglycane qui se trouve à la surface des hiPSC, qui est essentiel à la perception des protéines extracellulaires SHH, Wnts et Fgfs. En utilisant un shRNA ciblant GPC4, nous avons généré des lignées stables avec une régulation négative de 60 à 75% de GPC4. Les cellules contrôles et GPC4-mut expriment des niveaux de marqueurs de l’état souche comparables, tels que Nanog, Oct4, Sox2,SSEA-4,Tra-1-60, en conservant des propriétés de croissance similaires. Suite à une xénogreffe chez des souris, nous avons constaté que les GPC4-mut développaient de petites masses tissulaires,alors que les cellules contrôles généraient des tumeurs 5 fois plus grosses. Cette altération du potentiel tumorigénique pourrait constituer une nouvelle stratégie visant à réduire les risques de tumeurs liés aux hiPSC dans les TC.Dès les premiers stades de la différenciation en neurones DA in vitro (jour 5 à 15),j'ai observé que la régulation négative du GPC4 augmente les niveaux d'expression des marqueurs de progéniteurs DA CORIN, FOXA1, FOXA2, SHH, LMX1A, LMX1B, OTX2. De plus, la co-expression de FOXA2, LMX1A et OTX2, qui est une caractéristique unique des progéniteurs DA, est augmentée aux jours 9, 12 et 15. Cette efficacité de différenciation est spécifique à la lignée dopaminergique. Dans les cellules GPC4-mut, les marqueurs de cellules souches neurales NESTIN, SOX1 et SOX2 sont diminués ou identiques aux contrôles. La répression des marqueurs cérébraux postérieurs NKX2.2, HOXA2 et GBX2 montrent un dérèglement des voies alternatives. Du jour 22 à 50, les cellules contrôles et les GPC4-mut expriment toutes deux des marqueurs neuronaux DA TH, NURR1, PITX3, VMAT2, DDC, ALDH1A1, DRD2, GIRK2 et DAT. J’ai observé une amélioration de la différenciation DA, et une diminution du nombre de cellule en division, visible par l’augmentation de l’expression de NURR1 et PITX3, entre le jour 22 et 35. La génération et la maturation des neurones DA sont amplifiés dans les cultures mutantes, comme l'indiquent l'augmentation du nombre de neurones TH+ (jour 26 et 50) et DAT+ (jour 50). Enfin, pour étudier l’effet de la diminution de GPC4 in vivo, nous avons greffé des progéniteurs DA (jour 5) dans le striatum de rats modèles pour la MP. Deux mois après, des analyses ont montré que, même si toutes les cellules contrôles et mutantes étaient engagées dans la voie neurale (comme le montre l'expression de hNCAM), les greffes de cellules GPC4-mut étaient enrichies en progéniteurs DA FOXA2+/LMX1A+. L’ensemble des résultats de cette thèse fournissent de nouvelles informations sur la génération de cultures de DA, ainsi que des protocoles de différenciation plus standardisés, qui peuvent être utilisés pour la découverte de médicaments ou pour augmenter l’efficacité, le rendement et la qualité des produits thérapeutiques dérivés de hiPSC.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are a breakthrough for biomedical science, as they can generate an unlimited number of somatic cells for disease modelling, drug screening and cell replacement therapy (CRT). The derivation of dopaminergic (DA) neurons from hiPSCs appears as a promising alternative to the use of hESCs or fetal tissue for CRT in Parkinson´s disease (PD). Using the appropriate cues in vitro, hiPSCs can be patterned towards ventral midbrain (vm) DA neurons that survive, integrate into the host structure, and provide functional recovery when transplanted into animal models of PD. Nevertheless, current differentiation protocols are not optimal yet: the differentiation efficiency varies in different experiments, yielding neurons from a mix of different lineages, and undifferentiated SCs can persist and cause tumour growth upon in vivo transplantation. In this thesis, I investigated the possibility of increasing hiPSC differentiation into DA neurons both in vitro and in vivo by modulating cell signalling perception through Glypican4 (GPC4) downregulation. GPC4 is a cell surface heparan sulfate proteoglycan and it is crucial for fine-tune perception of extracellular proteins like SHH, Wnts and Fgfs. By lentivirus-mediated delivery of a GPC4-targeting shRNA, we generated stable GPC4-mut hiPSC lines, with a 60 to 75% downregulation of GPC4. Control and GPC4-mut cells express comparable levels of the stemness markers Nanog, Oct4, Sox2, SSEA4, Tra-1-60 and retain similar growth properties, meaning that GPC4-mut cells maintain self-renewal in stemness conditions. By performing flank xenograft in nude mice, we found that GPC4-mut cells developed small tissue masses, whereas control hiPSCs generated 5-fold bigger tumors. This impaired tumorigenic potential might be a new strategy to reduce tumor risks of hiPSCs in CRT. When differentiating cells into vmDA neurons in vitro, I observed that GPC4 downregulation enhanced efficiency of the whole differentiation process already at early time points (day 5 to day 15) and increased expression levels of DA progenitor markers like CORIN, FOXA1, FOXA2, SHH, LMX1A, LMX1B, OTX2 (2- to 4-fold). A unique feature of vmDA progenitors is the coexpression of FOXA2, LMX1A and OTX2, that was 2- to 4- fold higher at day 9, 12 and 15 in GPC4-mut cells. This increased differentiation efficiency was specific for the dopaminergic lineage. In GPC4-mut line, neural SC markers like NESTIN, SOX1 and SOX2 were downregulated or equally expressed and alternative fates were disadvantaged, as shown by downregulation of hindbrain markers NKX2.2, HOXA2 and GBX2. The robust vmDA differentiation efficiency of GPC4-mut cells persisted at late time points (day 22 to 50). Both Control and GPC4-mut cells expressed vmDA neuron markers like TH, NURR1, PITX3, VMAT2, DDC, ALDH1A1, DRD2, GIRK2 and DAT. In GPC4-mut line, I observed an enhanced vmDA neuron identity and a more efficient depletion of dividing cells, as revealed by the higher expression level of NURR1 and PITX3 mRNA at day22-35. VmDA neuron generation and maturation were also more pronounced in GPC4-mut cultures as assessed by the 2-fold increase of TH+ cells (day 26 and day 50) and the 2- to 3- fold increase of DAT+ neurons (day 50). Finally, to investigate the effect of Gpc4 downregulation in vivo, we transplanted early DA progenitors (day 5) into the striatum of PD rats. Analyses of dissected brains at two-month post-transplantation showed that, even if all control and mutant cells were neural committed (as shown by the expression of hNCAM), grafts of GPC4-mutant cells were enriched into FOXA2+/LMX1A+ DA progenitors (5-fold increase). Overall, the results of this thesis provide new insights into generation of more standardized vmDA cultures and differentiation protocols, which can be in turn used in the field of drug discovery or as robust platform to increase efficiency, throughput scale and quality of hiPSC-derived therapeutic products.