Soutenance de thèse de Abdenour ABBAS

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules immunitaires spécialisées dans la production de grandes quantités d'interférons de type I et III (IFN), des cytokines critiques pour la défense de l'hôte contre les infections virales. En plus des IFN, les pDC de souris peuvent également produire des niveaux élevés d'autres cytokines, dont le TNF, le CCL3 et l'IL-12. En revanche, les pDC humaines ne sont pas en mesure de produire l'IL-12. À l'état basal, les pDC humaines et murines n'ont pas la capacité d'effectuer la présentation d’antigènes et l’activation des lymphocytes T. Les pDC peuvent acquérir ces fonctions après une activation appropriée, en se différenciant en cellules ressemblant aux cellules dendritiques classiques (cDC). Toutefois, cette capacité a été remise en question très récemment, en raison de la contamination des pDC humaines et murines par de nouveaux types de cDC qui seraient responsables de toutes les propriétés d'activation des lymphocytes T précédemment attribuées aux pDC. Plus généralement, plusieurs études ont rapporté l'existence de sous-populations ou d'états d'activation de pDC distincts et dotés de fonctions différentes. Toutefois, aucun consensus n'a été atteint jusqu'à présent quant à la description précise et à l'interprétation de cette hétérogénéité apparente des pDC. La question est toujours ouverte de savoir si cette hétérogénéité reflète une spécialisation fonctionnelle au sein des pDC, et si elle est déjà présente à l’état basal ou si elle résulte de l'acquisition d’états d'activation distincts par différentes pDC en fonction de la combinaison des stimuli qu’elles ont reçus, voir si au moins une partie de cette hétérogénéité est due à la contamination par d'autres types de cellules, y compris par les cDC. La pulpart des études antérieures à mon travail qui ont tenté de caractériser l'hétérogénéité fonctionnelle des pDC de souris par séquençage d’ARN et/ou en mesurant la sécrétion de cytokines l’ont fait au niveau de populations cellulaires présélectionnées de façon biaisée sur la base de connaissances préalables de l’hétérogénéité phénotypique de ces cellules. Cette stratégie a conduit à moyenner les paramètres mesurés pour toutes les cellules individuelles, ce qui a entraîné une sous-estimation de l'hétérogénéité et de la contamination croisée entre sous-populations de pDC ou avec d'autres types cellulaires. En revanche, les analyses de cellules uniques ont fourni des informations d’une précision sans précédent sur la diversité des autres types de cellules et de leurs états d'activation, révélant un degré inattendu d’hétérogénéité cellulaire. Au cours de mon projet de thèse, pour caractériser l'hétérogénéité fonctionnelle des pDC de souris, j’ai combiné l’utilisation d’une souche de souris rapportrice pour le gène Ifnb1 qui permet de suivre la production d’IFN avec l’étude du phénotype et de l’expression génique de cellules individuelles, par cytométrie de flux et par séquençage d’ARN (scRNA-seq). Ainsi, j’ai pu déterminer la trajectoire d'activation des pDC de souris in vivo lors d'une infection virale, notamment en suivant le sort de chaque pDC après l'arrêt de production des IFN. Cela nous a permis d'inférer et de tester expérimentalement des hypothèses sur la spécialisation fonctionnelle sous-jacente des états d'activation des pDC et leur régulation moléculaire. Nous avons montré que les mêmes pDC effectuaient la production d'IFN et l'activation des lymphocytes T, mais séquentiellement dans le temps et à différents endroits micro-anatomiques. De plus, nous avons montré que la signalisation TNF favorise la production d'IFN par les pDC. Dans l'ensemble, cette étude nous a permis de proposer un nouveau modèle pour l'activation dynamique des pDC in vivo lors d'une infection virale et comment cela leur confère la capacité d'exercer différentes fonctions d'une manière étroitement orchestrée dans le temps et l'espace.

Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are immune cells specialized in the production of large quantities of type I and III interferons (IFN), which are cytokines critical for the host defense against viral infections. In addition to IFN, mouse pDC can also produce high levels of other cytokines, including TNF, CCL3 and IL-12. However, human pDC are not able to produce IL-12. At steady state, human and murine pDC do not have the ability to perform antigen presentation and T cell activation. They can acquire these functions after appropriate activation, by differentiating into cells similar to conventional dendritic cells (cDC). However, this ability has been questioned very recently due to the reported contamination of human and murine pDC by new types of cDC that are proposed to be responsible for all of the T cell activation properties that had been previously assigned to pDC. More generally, several studies have reported the existence of distinct pDC subsets or activation states with different functions. However, no consensus has been reached so far on the precise nature of this apparent heterogeneity of mouse pDC and on its interpretation. The question remains open as to whether this heterogeneity reflects a functional specialization within the population of pDC and, if yes, whether this is already present at steady state or rather instructed upon activation depending on the combination of stimuli received by individual cells, or even whether this heterogeneity is at least in part due to contamination by other cell types, including cDC. Previous studies that have attempted to characterize the functional heterogeneity by measuring gene expression and/or by cytokine production were performed at the level of cell populations, on subsets of pDC that had been selected in a biased manner based on a priori knowledge pDC phenotypic heterogeneity. Within each of the pDC subset studied, this strategy led to the averaging across individual cells of the parameters measured, which led to an underestimation of the heterogeneity of these pDC subsets and of their contamination by one another or by other cell types. In contrast, single cell analyses provided information of unprecedented accuracy and depth on the diversity of other cell types and activation states, revealing an unexpected degree of cell heterogeneity. During my thesis project, to characterize the functional heterogeneity of mouse pDC, I simultaneously studied the production of IFN, the phenotype and the gene expression profiles of hundreds of pDC at the single cell level, by combining the use of an Ifnb1 reporter mouse strain with flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). Thus, I was able to uncover the activation trajectory of mouse pDC in vivo during a viral infection, in particular by following the fate of each pDC after the termination of their IFN production. This allowed us to experimentally infer and test hypotheses on the underlying functional specialization of pDC activation states and their molecular regulation. We showed that IFN production and T cell activation were performed by the same individual cells, but sequentially in time and at different microanatomical locations. In addition, we showed that TNF signaling promotes the production of IFN by pDC. Overall, this study allowed us to propose a new model for the dynamic activation of pDC in vivo during a viral infection and how it endows them with the ability to perform different functions in a manner tightly orchestrated in time and space.