Soutenance de thèse de Kamal ZEAMARI

La nitrate réductase périplasmique (Nap) est une enzyme bactérienne à molybdène qui catalyse la réduction à deux électrons du nitrate en nitrite. Elle appartient à la vaste famille d’enzymes à cofacteur Mo-bis(pyranoptérine dinucléotide), ou Mo-bis(PGD), enzymes impliquées dans les grands cycles biogéochimiques d’éléments essentiels (N, C, S) ou plus exotiques (As par exemple). Cette enzyme est structuralement très proche de la formiate déshydrogénase (Fdh), qui catalyse l’oxydation du formiate et/ou la réduction du CO2. Nous nous intéressons à la compréhension des déterminants moléculaires pilotant la réactivité de cette sous-famille d’enzymes (Nap, Fdh) dont les substrats présentent des potentiels très différents (E°'pH7 = +430 mV vs ESH pour le couple nitrate/nitrite contre -430 mV pour le couple CO2/formiate). La nitrate réductase périplasmique de Rhodobacter sphaeroides possède, en plus du cofacteur à Mo, un centre [4Fe-4S] et deux hèmes de type c formant une chaîne de transfert électronique intramoléculaire. Ce travail est centré sur deux aspects moléculaires de la catalyse de cette enzyme : la réactivité au niveau du site actif de l’enzyme et les processus de transfert d’électrons intramoléculaires. Ces questions sont abordées en s’appuyant parallèlement sur des approches de mutagénèse dirigée, d’activités enzymatiques, de spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) en onde continue (CW) et impulsionnelle, de spectroscopie UV-Vis et sur des mesures de potentiels redox associés aux cofacteurs de l’enzyme. Une première partie de ce travail est consacrée à la caractérisation spectroscopique et physico-chimique (propriétés thermodynamiques et cinétiques) d’intermédiaires Mo(V) du site actif afin de déterminer leur structure et leur positionnement possible dans le cycle catalytique. Nous avons ainsi étudiée de manière détaillée deux intermédiaires Mo(V) du site actif en présence de nitrate dont nous montrons qu’ils présentent des différences structurales au-delà de la première sphère de coordination du Mo. Dans une seconde partie, nous mettons en évidence le rôle d'un acide aminé très conservé (Lys) dans le transfert d'électrons intramoléculaire. Cet acide aminé chargé positivement est situé dans la seconde sphère de coordination du centre [4Fe-4S] et joue un rôle majeur dans la modulation des propriétés rédox du centre [4Fe-4S], ce qui affecte fortement les propriétés catalytiques de l'enzyme. L’ensemble de nos résultats permettent ainsi d’identifier dans l’environnement du Mo des éléments déterminants dans la réactivité de l’enzyme.

Periplasmic nitrate reductase (Nap) is a bacterial molybdenum enzyme that catalyzes the 2-electron reduction of nitrate into nitrite. It belongs to the large family of enzymes containing a Mo-bis(pyranopterin dinucleotide) cofactor, or Mo-bis (PGD), which are involved in major biogeochemical cycles of essential (N, C, S) or more exotic (As for example) elements. This enzyme is structurally closely related to the formate dehydrogenase (Fdh), which catalyzes formate oxidation and/or CO2 reduction. We aim at understanding the molecular determinants of the reactivity within this enzymes subfamily (Nap, Fdh), whose substrates display very different reduction potentials (E ° 'pH7 = +430mV vs SHE for nitrate/nitrite vs - 430 mV for the CO2/formate). The periplasmic nitrate reductase from Rhodobacter sphaeroides contains, in addition to the Mo-cofactor, a [4Fe-4S] center and two c-type hemes defining an intramolecular electron transfer chain. This work focuses on two molecular aspects of the catalysis: the reactivity of the Mo-cofactor, and the intramolecular electron transfer step. These issues are dealt by combining approaches as site-directed mutagenesis, enzymatic activities, continuous-waves (CW) and pulse electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR), UV-Vis spectroscopy and redox titration of metal cofactors of the enzyme. A first part of this work is devoted to the spectroscopic and physicochemical characterization (thermodynamic and kinetic properties) of Mo (V) intermediates of the active site in order to determine their structure and their catalytic relevance. We have undertaken a detailed characterization of two Mo(V) intermediates generated in presence of nitrate, which display some structural differences beyond the first coordination sphere of the Mo(V) ion. In a second part, we highlight the role of a highly conserved amino acid (Lys) in intramolecular electron transfer. This positively-charged amino acid is located in the second coordination sphere of the [4Fe-4S] center and plays a major role in the redox properties tuning of the [4Fe-4S] center thus strongly affecting the catalytic properties of the enzyme. All together, these data provide some structural insights on the enzyme reactivity beyond the first coordination sphere of the Mo-cofactor.