Soutenance de thèse de Francesca TROILO

Cette thèse étudie les mécanismes moléculaires du repliement des protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs). Les IDPs ou IDRs (régions intrinsèquement désordonnées) sont des protéines ou des domaines dépourvus d'une structure tridimensionnelle bien définie dans des conditions physiologiques. Malgré (ou grâce à) l'absence de structure, les IDPs/IDRs sont fonctionnelles et participent à de nombreuses fonctions biologiques. Généralement, lors de la liaison avec leurs partenaires, les IDPs/IDRs subissent une transition désordre-ordre dans des régions spécifiques, ayant une propension à se replier, appelées éléments de reconnaissance moléculaire (MoREs). Deux mécanismes extrêmes sont utilisés pour décrire le repliement des IDPs/IDRs lors de leur liaison à un partenaire: la sélection conformationnelle (le repliement précède la liaison au partenaire) ou le repliement induit (le repliement suit la liaison au partenaire). Dans cette thèse, nous avons étudié l'interaction entre NTAIL, le domaine intrinsèquement désordonné de la nucléoprotéine (N) du virus de la rougeole (MeV), et son partenaire XD, le domaine X de la phosphoprotéine (P) virale. L’étude de la cinétique de l'interaction des IDPs avec leurs partenaires est une technique expérimentale puissante pour obtenir des informations sur le repliement couplé à la liaison des IDPs. Une approche courante pour étudier la cinétique consiste à induire le repliement de l'IDP/IDR en mélangeant l’IDP/IDR avec son ligand et en suivant la réaction par spectroscopie optique. L'interaction NTAIL-XD du MeV étant très rapide, nous avons utilisé la technique de relaxation par saut de température. Dans cette méthode, un système à l'équilibre (dans ce cas NTAIL lié à XD et donc replié) est perturbé par une augmentation rapide de la température. Le retour au nouvel équilibre est alors mesuré par la variation d'une sonde optique, telle que la fluorescence d'un résidu aromatique (tryptophane, tyrosine), en fonction du temps d'acquisition. Le « fit » de la courbe résultante est ensuite utilisé pour calculer la constante de vitesse de la réaction observée. Il avait été précédemment montré que l'α-MoRE (résidus 489-506) de NTAIL subit un repliement α-hélical après liaison à XD, alors que les régions adjacentes restent désordonnées (« fuzzy ») au sein du complexe. Il avait également été montré que le long appendice désordonné (« fuzzy ») précédant l'α-MoRE diminue l’affinité de liaison avec XD, ainsi que la vitesse de repliement de l'α-MoRE. Dans cette thèse, en produisant de nombreux variants de NTAIL (variants ponctuels, tronqués et artificiels) et en effectuant des expériences de cinétique de l’interaction avec XD, nous avons étudié le mécanisme de repliement de NTAIL à l’échelle du résidu, ainsi que le mécanisme à travers lequel la région « fuzzy » réduit l'affinité de liaison avec XD. Ces expériences ont révélé que NTAIL se replie via un mécanisme de nucléation-condensation, la partie centrale de l'hélice étant responsable des interactions initiales menant à la formation du complexe. De plus, nous avons montré que la région « fuzzy » réduit la vitesse de repliement de l'α-MoRE via une combinaison d'effets entropiques et enthalpiques. Nous avons également étudié l'interaction entre NTAIL et un variant de XD, I504A, qui, à la différence de la forme sauvage, adopte uniquement la conformation native. Ces études ont montré que les étapes de liaison et de repliement de NTAI dépendent fortement de la forme de XD, suggérant que cette IDP se replie par nucléation hétérogène via un mécanisme induit par la forme du partenaire (« templated folding »). Enfin, nous avons également étudié l'interaction entre NTAIL et la protéine de choc thermique de 70 kDa (Hsp70). Des approches mutationnelles combinées à des essais de liaison ont montré que NTAIL lie Hsp70 et XD en utilisant différents mécanismes, confirmant ainsi l'extrême polymorphisme des IDPs.

This thesis studies the molecular mechanisms of folding of intrinsically disordered proteins (IDPs). IDPs or IDRs (intrinsically disordered regions) are proteins or domains lacking of a well-defined tridimensional structure in physiological conditions. Despite (or thanks to) the lack of structure, IDPs/IDRs are fully functional and are involved in many biological functions. Usually, upon binding with their partners, IDPs/IDRs undergo a (partial) disorder-to-order transition in specific regions, prone to the folding, called Molecular Recognition Elements (MoREs). Two extreme mechanisms are used to describe the folding of IDPs/IDRs upon their binding to a partner: conformational selection (the folding occurs before the binding with the partner) or induced fit (the folding occurs after the binding with the partner). In this thesis, we studied the interaction between the intrinsically disordered domain of the nucleoprotein (N) of Measles virus (MeV), NTAIL, and its partner XD, the X domain of the MeV phosphoprotein (P). A powerful experimental technique to obtain information about the induced folding of IDPs/IDRs consists in studying the kinetics of the interaction with their partners. A common way to study the kinetics is to induce the folding of the IDP/IDR by mixing the disordered protein with its ligand and following the reaction by optical spectroscopy. In the case of the MeV NTAIL-XD interaction, since the reaction is very fast, the temperature-jump relaxation technique was used. In this method, a system at equilibrium (in this case NTAIL bound to XD and hence folded) is perturbed by a rapid increase in temperature. The return to the new equilibrium is then measured through the variation of an optical probe, such as the fluorescence of an aromatic residue (tryptophan, tyrosine), as a function of the acquisition time. The fit of the resulting curve is then used to calculate the observed rate constant of the reaction. It had been previously shown that the α-MoRE (residues 489-506) of NTAIL undergoes an α-helical folding after binding to XD (induced fit mechanism) while regions flanking the α-MoRE remain disordered (fuzzy) in the complex. The long, fuzzy appendage preceding the α-MoRE was shown to ,decrease the binding affinities towards XD and the rate of folding of the α-MoRE. In this thesis, by producing numerous NTAIL variants (single-site variants, truncation variants, artificial variants) and performing kinetic experiments of the interaction with XD, we studied the folding after binding mechanism of NTAIL at the single residue level, and investigated the mechanisms through which the fuzzy region hampers the binding affinity and the folding rate of the α-MoRE. These experiments unveiled that NTAIL folds via the so-called nucleation-condensation mechanism, with the central part of the helix being responsible for the initial interactions driving the binding with XD. Moreover, we found that the fuzzy region causes a decrease in the folding rate of the α-MoRE through a combination of entropic and enthalpic effects. We also studied the interaction between NTAIL and a variant of XD, I504A, that populates only the native state. These studies showed that both the binding and the folding steps of the NTAIL-XD interaction are highly dependent on the shape of XD, suggesting that this IDP folds by heterogeneous nucleation via a mechanism induced by the shape of the partner (templated folding). Finally, we also studied the interaction between NTAIL and the 70 kDa heat shock protein (Hsp70). Mutational studies combined with binding assays showed that NTAIL binds Hsp70 and XD using different mechanisms thus confirming the extreme polymorphism of IDPs.