Soutenance de thèse de Florian WERNERT

Les fonctions physiologiques des neurones sont rendues possibles par l'établissement de compartiments distincts et de processus cellulaires spécialisés lors du développement cellulaire. Au sein des neurones, l'endocytose médiée par la clathrine présente des caractéristiques uniques dans des compartiments tels que les dendrites et les boutons présynaptiques. Cependant, encore peu de choses sont connues sur la façon dont les composants membranaires et extracellulaires sont internalisés le long de l'axone. Dans ce travail de thèse, je me suis intéressé aux structures cellulaires à manteau de clathrine et à l'endocytose le long du segment initial de l'axone (AIS), ainsi qu'à leur relation avec l'échafaudage périodique d'actine/spectrine qui longe la membrane plasmique de l'axone. L'utilisation de technique de microscopie de super-résolution et microscopie électronique sur réplique de platine (PREM) sur des neurones d'hippocampes de rat en culture primaire révèlent que les puits de clathrine se forment dans des clairières circulaires formées par le réseau des spectrines au niveau du segment initial de l'axone. En ciblant l'actine, la clathrine ou les spectrines avec différentes drogues, j’ai pu observer des effets distincts sur l'organisation des puits de clathrine axonaux, suggérant que l'échafaudage de spectrine du cytosquelette régule l'accès à la membrane pour la formation des puits de clathrine. L'exploration de ces effets par des la visualisation de l'endocytose de cargo, de la clathrine et du cytosquelette en microscopie sur cellules vivantes ou fixées m'a permis de révéler que la plupart des puits de clathrine de l'AIS ont une durée de vie longue, et sont étroitement régulés par l'échafaudage d'actine et de spectrine qui régule l'accès à la membrane cellulaire. Pris dans leur ensemble, ces résultats mettent en lumière la façon dont le cytosquelette axonal participe à la régulation des échange à la membrane plasmique au sein d'un compartiment clé pour l'excitabilité et  la physiologie neuronale.

The physiological functions of neurons are made possible by the establishment of distinct compartments and specialized cellular processes during cell development. Within neurons, clathrin-mediated endocytosis shows unique features in compartments such as dendrites and presynaptic boutons. However, little is known about how membrane and extracellular components are internalized along the axon. In this thesis work, I focused on clathrin-coated structures and endocytosis along the axon initial segment (AIS), and their relationship to the periodic actin/spectrin scaffold that runs along the axon plasma membrane. The use of super-resolution microscopy and platinum replica electron microscopy (PREM) techniques on rat hippocampal neurons primary cultures reveals that clathrin pits assembles in the circular clearings formed by the spectrin mesh at the initial segment of the axon. By targeting actin, clathrin or spectrins with different drugs I was able to observe distinct effects on the organization of axonal clathrin pits, suggesting that the cytoskeletal spectrin scaffold regulates membrane access for clathrin pits formation. Exploring these effects through the visualization of cargo endocytosis, clathrin and cytoskeleton microscopy on live or fixed cells, I revealed that most AIS clathrin wells are long-lived and tightly regulated by the actin and spectrin scaffold that intermediates their access to the cell membrane. Taken together, these results shed light on how the axonal cytoskeleton participates in the regulation of plasma membrane exchange within a key compartment for neuronal excitability and physiology.