Soutenance de thèse de Julie WARNEZ

1. Etude de suivi longitudinal pour la détermination de phénomènes inflammatoires dans les membres inférieurs d’un modèle murin de calpaïnopathie Nous avons signifié que de précédents travaux ont mis en évidence une myosite à éosinophiles ou des infiltrations inflammatoires riches en macrophages à des stades précoces chez certains patients souffrant de calpaïnopathie, avec un rôle important des éosinophiles dans les dommages musculaires observés lié à une déficience en calpaïne-3. Il est intéressant de faire remarquer que des phénomènes inflammatoires ont aussi été observés chez des modèles murins de LGMD2A. C'est pourquoi nous avons décidé de mener une étude préliminaire de suivi longitudinal de souris déficientes en calpaïne-3 âgées de 2 mois à 8,5 mois (souris C57BL6/J Capn3-knock out comparées à des souris contrôle C57BL6/J) ; d'une part, par Imagerie à Résonance Magnétique afin de visualiser l’apparition ou non d’une inflammation et si oui, de pouvoir évaluer sa progression dans les muscles des membres inférieurs des animaux âgés de 2, 4, 6 et 8,5 mois ; d'autre part, d'identifier et de quantifier les sous-populations leucocytaires par cytométrie en flux, ainsi qu’identifier et comparer les cytokines et/ou chimiokines exprimées dans un muscle sain et un muscle LGMD2A de ces mêmes souris âgées de 2 mois et 8,5 mois par une analyse en PCR quantitative. Le but de cette étude est d’obtenir une vision générale des phénomènes inflammatoires et de la cinétique des leucocytes dans notre modèle murin de la calpaïnopathie afin de déterminer si l’utilisation de ce modèle dans des études immunologiques plus précises est judicieux. 2. Analyse de cohorte de patients LGMD2A ; Développement et évaluation d'outils en thérapie génique Nous savons que les différentes mutations du gène CAPN3 peuvent avoir un impact soit sur l’expression de la protéine calpaïne-3, soit sur son activité enzymatique entrainant ainsi des phénotypes plus ou moins sévères chez les patients. Du fait que l’hôpital la Timone à Marseille possède une cohorte de plus de 300 patients porteurs de mutations sur le gène CAPN3, réparties sur la totalité du gène, nous avons décidé de faire des analyses in silico de ces mutations, à savoir leur fréquence, leur pathogénicité, leur impact sur l’épissage, leur impact sur l’expression et l’activité de la protéine calpaïne-3 afin de cibler les outils de thérapie génique les plus appropriés pour restaurer l’expression et/ou les fonctions d’une calpaïne-3 fonctionnelle. C'est pourquoi, en parallèle, nous avons décidé de développer et de tester des approches thérapeutiques sur des lignées immortalisées de myoblastes issus de biopsie musculaire de patients LGMD2A. Les deux approches que nous avons sélectionnées sont : - La compensation intermoléculaire : en utilisant la propriété naturelle de la calpaïne-3 de s'autolyser en 2 fragments Cter et Nter pour former des hétérodimères capables d’une activité enzymatique pour lyser ses substrats, nous souhaitons pouvoir restaurer ou améliorer l'activité enzymatique de la calpaïne-3 en compensant l'absence ou le manque d'activité d'un des deux fragments autolytiques selon la mutation présente chez le patient (ici, selon la lignée cellulaire) à l'aide d’un vecteur d'expression approprié; - La technologie SMaRT : pour rétablir l’expression et l’activité d’une calpaïne-3 fonctionnelle, nous voulons faire exprimer un ARNm chimère issu du trans-épissage ne comportant aucune mutation en déviant le cis-épissage grâce à l'apport de molécules de trans-épissage contenant les exons 5 à 24 de l'ARNm du gène CAPN3 par transfection des cellules et évaluer dans un premier temps son expression dans ces lignées de myoblastes humains mutées.

1. Longitudinal follow-up study to determine inflammatory phenomena in the lower limbs of a mouse model of calpainopathy Previous works highlighted an eosinophilic myositis or inflammatory rich-macrophages infiltrations in early stages in certain patients suffering from LGMD2A, with an important role of eosinophils in the observed muscular damage bound to a deficiency of calpain-3. It is interesting to point out that inflammatory phenomena were also observed in mouse models of LGMD2A. That is why we decided to lead a preliminary longitudinal follow-up study of calpain-3 deficient mice from 2-months to 8,5 months of age (mouse C57BL6/J Capn3-knock out compared with mouse C57BL6/J as control) ; on one hand, by Magnetic Resonance Imaging to visualize the appearance or not of an inflammation and if yes, being able to estimate its progress in lower limbs muscles of animals at 2, 4, 6 and 8,5 months of age; on the other hand, to identify and quantify subpopulations of leukocytes by flow cytometry, as well as identify and compare cytokines andor chemokines expressed in a healthy muscle and a LGMD2A muscle of these same 2-month-old mice and 8,5 month-old mice by a quantitative PCR analysis. The purpose of this study is to obtain a general vision of the inflammatory phenomena and the kinetics of leukocytes in our mouse model of calpainopathy to determine if the use of this model in more precise immunological studies is sensible. 2. Analysis of LGMD2A patients' cohort; development and evaluation of tools in gene therapy We know that the various mutations of CAPN3 gene can have an impact either on the expression of the calpain-3 protein, or on its enzymatic activity so causing more or less severe phenotypes at patients. Because Timone hospital in Marseille possesses a cohort of more than 300 patients carrying CAPN3 gene mutations, distributed on all of gene; we decided to make in silico analyses of these mutations, worth knowing their frequency, their pathogenicity, their impact on splicing, their impact on expression and activity of calpain-3 to target tools of gene therapy the most suited to restore expression and/or functions of a functional protein. That is why, in parallel, we decided to develop and to test therapeutic approaches on human immortalized myoblast lineages stemming from LGMD2A patients' muscular biopsy. Two approach that we selected are: - Intermolecular complementation: By using the natural property of calpain-3 to autolyse in 2 Cter and Nter autolytic fragments to form heterodimer capable of an enzymatic activity for lyse its substrata, we wish we can restore or we improve enzymatic activity of calpain-3 by compensating for the absence or lack of activity of one of the two autolytic fragments according to mutation carried by patient (here, according to the cellular lineage) by means of an appropriate vector of expression. - SMaRT technology: To restore expression and activity of a functional calpain-3, we want to make express a chimeric mRNA stemming from trans-splicing containing no mutation by diverting the cis-splicing thanks to the contribution of molecules of trans-splicing containing exons 5 - 24 of mRNA of CAPN3 gene by transfection of the cells and to estimate at first its expression in these lineages of human myoblast carrying CAPN3 mutations.