Soutenance de thèse de Edoardo SALLADINI

Pour contrecarrer la réponse humaine médiée par l'interféron les virus ont développé diverses stratégies. Chez les paramyxovirus, l’une de ces stratégies consiste à détourner le complexe cellulaire de l’ubiquitine ligase E3 pour favoriser la dégradation rapide des protéines STAT. Cette activité repose sur la capacité de la protéine virale V à lier DDB1, un composant du complexe ubiquitine ligase E. L'interaction entre V et DDB1 est donc une cible prometteuse pour des stratégies antivirales visant à neutraliser la capacité de ces virus à échapper à la réponse immunitaire innée de l'hôte. Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont des pathogènes humains de classe 4 appartenant au genre Henipavirus dans la famille des Paramyxoviridae. L'objectif de ma thèse était d'évaluer et de caractériser la capacité des protéines V des henipavirus à interagir avec DDB1 en tant que première étape vers le développement d'inhibiteurs qui pourraient être utilisés comme antiviraux. La protéine V comporte un domaine N-terminal désordonné (PNT), et un domaine C-terminal à doigts de zinc (ZnFD). Au début de cette thèse, les informations moléculaires sur la protéine V étaient peu nombreuses et concernaient principalement le domaine PNT. En combinant diverses approches biochimiques et biophysiques, j'ai caractérisé les deux protéines V en solution et j'ai montré que la présence du ZnFD structuré n'a aucun impact sur la conformation de PNT. J'ai ensuite déterminé l'affinité de l'interaction entre V et DDB1 et j’ai montré que le ZnFD joue un rôle important. La disponibilité de données structurales constituant un atout pour la conception rationnelle d'inhibiteurs de l’interaction, j'ai ensuite réalisé des expériences de cristallisation du ZnFD. J'ai pu identifier quelques conditions prometteuses qui nécessitent toutefois une optimisation supplémentaire afin d'obtenir des cristaux adaptés à la collecte de données de cristallographie aux rayons X. En parallèle, j'ai également étudiée le domaine PNT du NiV par SAXS et RMN en vue d'obtenir une description atomistique de ce domaine en tant qu’ensemble conformationnel. L'attribution du spectre RMN d'une protéine désordonnée de telle grande taille (406 résidus) est extrêmement difficile. En utilisant des expériences de RMN à haute dimension, j'ai pu attribuer à ce jour jusqu'à 80% des résidus. Au cours de ma thèse, j'ai également découvert que la protéine V du HeV subit une transition de phase de liquide à hydrogel. En utilisant une approche par domaines, j'ai identifié la région responsable de ce comportement. Cette région, appelée PNT3, est située au sein du domaine PNT. Elle contient une région de faible complexité de séquence et un motif YYY compatible avec un noyau amyloïde. J’ai ensuite purifié la protéine PNT3 et montré qu’elle est capable de subir une séparation de phase. Par des expériences de liaison à la Thioflavine T et au Rouge Congo, ainsi que de microscopie électronique, j’ai montré que cette région forme des fibrilles de type amyloïde. Le motif YYY de PNT3 a été muté, et la protéine mutée s’est avérée incapable de former des amyloïdes, confirmant ainsi que ce motif constitue un noyau amyloïdogénique. Finalement, après transfection dans des cellules de mammifères, j’ai montré que la PNT3 de type sauvage (wt), mais pas la protéine mutée, forme des structures de type amyloïde également in cellula. En outre, les cellules exprimant la PNT3 se sont révélées plus sensibles au stress, suggérant un effet toxique. De manière intéressante, la protéine mutée a une toxicité plus faible, ce qui suggère que l’effet toxique serait lié à la formation d’amyloïdes. Bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents restent à être élucidés, les présents résultats fournissent des preuves d'un nouveau mécanisme de toxicité cellulaire induite par le virus, ouvrant ainsi de nouvelles voies de recherche.

In order to counteract the human interferon-mediated response, viruses have developed various strategies. One such a strategy, which is shared by several paramyxoviruses, consists in hijacking the cellular ubiquitin ligase E3 complex to promote the rapid degradation of STAT proteins. This activity relies on the ability of the viral V protein to bind DDB1, a component of the ubiquitin ligase E3 complex, thereby putting the latter in contact with STAT proteins. The interaction between V and DDB1 is therefore a promising target for antiviral strategies aimed at counteracting the ability of these viruses to escape the host innate immune response. The Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses are biosafety level 4 human pathogens belonging to the Henipavirus genus within the Paramyxoviridae family. The objective of my thesis was to assess and characterize the ability of Henipavirus V proteins to interact with DDB1 as a first step towards the development of inhibitors that could be used in antiviral approaches. The V protein, whose sequence is conserved in NiV and HeV, is composed of two domains: a N-terminal disordered domain, called PNT, and a C-terminal zinc-finger domain (ZnFD). At the beginning of this thesis molecular information on the V protein was scarce and mostly concerned the PNT domain. Using a combination of biochemical and biophysical approaches, I have characterized the two V proteins in solution and I showed that the presence of the structured ZnFD has no impact on the PNT conformation. Subsequently, I determined the binding affinity of the V-DDB1 interaction and showed that the ZnFD plays an important role. Considering that the availability of structural data constitutes an important asset for the rational design of interaction inhibitors, I next performed crystallization experiments on the ZnFD from both viruses. I could identify a few promising conditions that deserve further optimization in order to obtain crystals suitable for X-ray data collection. Besides crystallization trials, I also used a combination of SAXS and NMR in view of achieving an atomistic ensemble description of NiV PNT. The assignment of the NMR spectrum of such a large intrinsically disordered protein (406 residues) is extremely challenging. Using high-dimensional NMR experiments and carbon-detected experiments, I could assign so far as much as 80 % of the residues. Concomitantly, in the course of the characterization of HeV V, I serendipitously discovered that it undergoes a liquid to hydrogel transition. Using a domain-based approach, I identified the region responsible for this peculiar behavior. This region, referred to as PNT3, is located within PNT. Computational analyses showed that it contains a region of low sequence complexity and a tyrosine triplet that is consistent with an amyloid core. PNT3 was purified and shown to be able to phase separate. ThioflavinT and Congo Red binding assays, together with negative-staining transmission electron microscopy studies, showed that this region forms amyloid-like fibrils. The YYY motif of PNT3 was mutated to ascertain its role in fiber formation. The mutated protein is unable to form amyloids, thus confirming that the triple tyrosine motif constitutes a hydrophobic core that enhances amyloid formation. Finally, both wild-type (wt) PNT3 and its mutated form were transfected in mammalian cells. Wild-type PNT3, but not the mutated protein, forms amyloid-like structure also in these cells. In addition, cells expressing the viral protein were found to be more sensitive to stress, suggesting a toxic effect. Noteworthy, the mutated protein has a lower toxicity, arguing for an amyloid-specific toxic effect. Although the underlying molecular mechanisms remain to be elucidated, the present findings provide evidence for a new mechanism of virus-induced cell toxicity, thus opening new research avenues.