Soutenance de thèse de Elisa PIERI

En plus de nombreuses autres propriétés chimiques et physiques, le pH de l'environnement peut modifier la manière dont une macromolécule biologique photoactive interagit avec la lumière, comme par exemple les changements des spectre d'absorption / émission ou la durée des étapes d’un photocycle. La modélisation de tels phénomènes d'un point de vue théorique et calculatoire n'est pas une tâche triviale, car, à un pH donné, les états de protonation des sites titrables dans la biomolécule varient continuellement et créent un vaste ensemble statistique de microétats accessibles par la macromolécule. Cela implique que l'utilisation d'une seule distribution fixe d'états de protonation est peu réaliste et généralement insuffisante pour modéliser des propriétés dépendantes du pH. Durant cette thèse, nous avons développé un protocole de calcul associant la dynamique moléculaire à pH constant dans un solvant explicite, une technique récente qui permet d’échantillonner à la fois les espaces conformationnels et les états de protonation, avec un schéma hybride mécanique quantique / mécanique moléculaire pour calculer la dépendance au pH des spectres d'absorption et de la dynamique dans les états excités, via une approche statistique. Dans un premier temps, nous avons développé et testé notre protocole sur un système biologique relativement simple, le Peptide M; ce 18-mère synthétique présente un spectre d'absorption qui dépend fortement du pH de l'environnement et contient une association tyrosine-tryptophane et deux autres acides aminés titrables. Notre protocole a été capable de capturer les minuscules changements induits sur le maximum d'absorption par des modifications de l'état de protonation des résidus titrables. De plus, des hypothèses sur l'implication de l'espèce radicalaire tyrosile résultante d'une ionisation photo-induite ont été avancées. Une fois que le protocole s'est avéré solide, nous l'avons adapté et appliqué à l’étide de la rhodopsine sensorielle d'Anabaena (ASR), fonctionnant comme un interrupteur moléculaire biologique transmembranaire dont les propriétés photochimiques dépendent du pH. Grâce à l'introduction d'outils d'analyse statistique intermédiaires, la version optimisée du protocole, composée d'une phase préliminaire d'exploration et d'une phase plus ciblée portant sur des gammes de pH spécifiques, nous a permis d'étudier en profondeur l'interaction entre les microétats de protonation fortement peuplés et les propriétés du chromophore de l’ASR, le rétinal, afin de comprendre l'origine moléculaire du spectre d'absorption dépendant du pH. Le résultat essentiel de l'étude est l'identification des principaux acides aminés responsables de cette modification de la photophysique de l’ASR. Enfin, nous avons utilisé notre approche statistique et les informations recueillies afin d’initier le calcul de la dynamique de l’état excité du rétinal, dépendant du pH, afin de mieux explorer le rôle des états de protonation des acides aminés titrables dans le processus de photoisomérisation réalisé par le rétinal après absorption du photon. Même si les résultats obtenus dans ce projet sont qualitatifs en raison de l'utilisation de méthodes de chimie quantique semi-empiriques, dictée par un compromis entre la précision souhaitée et l'effort de calcul massif requis par l’approche statistique, l'accord avec les données expérimentales est généralement bon. Le protocole final constitue un outil valable pour étudier les propriétés photochimiques et photophysiques dépendantes du pH et peut donc être adapté et appliqué à une large gamme de systèmes biologiques photoactifs.

Besides many other chemical and physical properties, the environmental pH can alter the way a biological photoactive macromolecule interacts with light; some examples are changes in the absorption / emission spectrum or the duration of the photocycle steps. Modeling such phenomena from a theoretical and computational point of view is not a trivial task, because, at a given pH, the protonation states of the titrable sites in the biomolecule change more or less fluidly creating a huge statistical ensemble of microstates that can be accessed by the macromolecule; this implies that the usage of a single fixed protonation states distribution is unrealistic and generally inadequate to model pH-dependent properties. In this thesis, we developed a computational protocol merging Constant pH Molecular Dynamics in explicit solvent, a recent technique that allows to sample at the same time the conformational and the protonation states spaces, into a hybrid quantum mechanics / molecular mechanics scheme to calculate pH-dependent absorption spectra and excited state dynamics with a statistical approach. Initially, we built and test our protocol on a relatively simple biological system, the Peptide M; this synthetic 18-mer features an absorption spectrum that heavily depends on the environmental pH and contains a tyrosine-tryptophan dyad and two other titrable amino acids. Our protocol was able to capture the tiny modifications induced on the absorption maximum by changes in the protonation state of the titrable residues. Moreover, hypotheses about the involvement of the tyrosil radical species as a results of a photo-induced ionization have been advanced. Once the protocol has proven to be solid, we applied it with the due modifications to the Anabaena Sensory Rhodopsin (ASR), a biological trans-membrane photoswitch whose photochemical properties depend on pH. With the introduction of intermediate statistical analysis tools, the optimized version of the protocol, composed of a preliminary phase of exploration and a more targeted phase addressing specific pH ranges, allowed us to study in depth the interplay between the significantly populated protonation microstates and the properties of the ASR chromophore, retinal, in order to understand the molecular origin of the pH-dependent absorption spectrum. The main outcome of the study is the identification of the principal amino-acids responsible for such a tuning of the ASR photophysics. Finally, we conveyed our statistical approach and the information gathered onto the calculation of pH-dependent excited state dynamics, in order to better explore the role of the titrable amino acids protonation states on the photoisomerization process accomplished by the retinal upon photon absorption. Even if the nature of the results obtained in this project is qualitative, due to the usage of semiempirical quantum-chemical methods dictated by a compromise between the desired accuracy and the massive computational effort required by the statistical style, the agreement with experimental data is generally good. The final protocol constitutes a valid tool to study pH-dependent photochemical and photophysical properties, and can therefore be adapted and applied to a wide range of photoactive biological systems.