Soutenance de thèse de Babacar MBAYE

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est devenue un problème majeur de santé publique dans le monde regroupant plusieurs stades évolutifs. Elle peut passer d’une stéatose simple (NAFL) à une stéatohépatite non alcoolique (NASH) qui peut évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie indépendamment de la consommation d’alcool, d’infection virale ou d’autres causes identifiées. Sa prévalence mondiale est estimée à plus de 25% dans les années à venir et évolue d’une façon exponentielle avec l’épidémiologie des maladies métaboliques (diabète, obésité et la dyslipidémie). Elle est devenue la principale cause de transplantation hépatique dans le monde avec une morbi-mortalité qui ne cesse d’augmenter. La NASH est l’une des formes avancées de la NAFLD caractérisée par une inflammation qui s’ajoute à la stéatose. Avant ce travail, le possible rôle d’une production endogène d’éthanol avait été rapporté en 2013. Le rôle d’une espèce microbienne digestive, Klebsiella pneumoniae, dans la production d’éthanol endogène a ensuite été démontré in vitro et in vivo en 2019. Cependant, cela n’avait pas été reproduit. De plus, la plausible implication d’autres espèces microbiennes dans ce mécanisme n’avait pas été établie. Pour clarifier cela, nous avons effectué une revue pour caractériser le répertoire des microbes humains capables de produire de l’éthanol. Suite à cela, nous avons réalisé deux études cas-témoins avec des patients atteints de NASH et des contrôles sains. L’éthanol fécal a été mesuré et le microbiote fécal caractérisé par culture spécifique des levures et des entérobactéries, par culturomique et par métagénomique. Enfin, nous avons testé la production in vitro d’éthanol des souches associées à la NASH. Ainsi, nous avons confirmé l’augmentation de l’éthanol fécal dans le contexte de la NASH et confirmé le rôle potentiel de souches de Klebsiella pneumoniae productrices d’éthanol. De plus, nous avons mis en évidence pour la première fois à notre connaissance le rôle possible de levures potentiellement pathogènes pour l’homme : Pichia kudriavzevii (anciennement Candida krusei), Candida albicans, et Candida glabrata. Ensuite, nous avons identifié grâce à la culturomique et la métagénomique plusieurs autres espèces et groupes bactériens comme une espèce de Lactobacillus « muqueux » connu en tant que fermenteur hétérolactique, et déjà associé à des troubles métaboliques chez l’homme : Limosilactobacillus fermentum, mais aussi Lactococcus lactis, une bactérie retrouvée dans le vin. Enfin, nous avons identifié plusieurs autres espèces candidates (Streptococcus mutans, Mediterraneibacter gnavus, Thomaclavelia ramosa et Enterocloster bolteae), toutes déjà connues pour être pathogènes ou associées à des maladies humaines. Ces résultats étaient cohérents avec notre revue de la littérature qui avait identifié les levures (principalement les Candida), les Lactobacillales (les bactéries lactiques, dont Limosilactobacillus), les enterobactéries (notamment Klebsiella) et les Lachnospiraceae (incluant Mediterraneibacter et Enterocloster) comme les groupes majeurs capables de produire de l’éthanol. Nos résultats confirment que les micro-organismes digestifs producteurs d'éthanol peuvent jouer un rôle déterminant dans la NASH. Klebsiella pneumoniae n'est pas donc le seul candidat. Afin d’identifier tous les candidats pour améliorer le diagnostic et la prise en charge, nous avons aussi montré que la culturomique et la métagénomique sont deux méthodes complémentaires non redondantes et essentielles pour identifier ces microbes clés en vue d'établir de futurs marqueurs de diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques. Mots clés : stéatohépatite non alcoolique ; microbiote intestinal ; mycobiome intestinal ; syndrome métabolique ; stéatose hépatique non alcoolique ; culturomique microbienne.

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has become a major public health problem worldwide, with several progressive stages. It can progress from simple steatosis (NAFLD) to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which can progress to cirrhosis or liver cancer independently of alcohol consumption, viral infection or other identified causes. Its worldwide prevalence is estimated to exceed 25% in the coming years and is evolving exponentially with the epidemiology of metabolic diseases (diabetes, obesity and dyslipidemia). It has become the leading cause of liver transplantation worldwide, with an ever-increasing morbidity and mortality rate. NASH is one of the advanced forms of NAFLD, characterized by inflammation in addition to steatosis. Prior to this work, the possible role of endogenous ethanol production had been reported in 2013. The role of a digestive microbial species, Klebsiella pneumoniae, in endogenous ethanol production was then demonstrated in vitro and in vivo in 2019. However, this had not been reproduced. Moreover, the plausible involvement of other microbial species in this mechanism had not been established. To clarify this, we carried out a review to characterize the repertoire of human microbes capable of producing ethanol. Following this, we carried out two case-control studies with NASH patients and healthy controls. Fecal ethanol was measured, and the fecal microbiota characterized by specific yeast and enterobacteria culture, culturomics and metagenomics. Finally, we tested the in vitro ethanol production of NASH-associated strains. We confirmed the increase in fecal ethanol in the context of NASH, and the potential role of ethanol producing Klebsiella pneumoniae strains. In addition, for the first time to our knowledge, we have highlighted the possible role of potentially human-pathogenic yeasts: Pichia kudriavzevii (formerly Candida krusei), Candida albicans, and Candida glabrata. Then, thanks to culturomics and metagenomics, we identified several other bacterial species and groups, such as a species of "mucosal" Lactobacillus known as a heterolactic fermenter, and already associated with metabolic disorders in humans: Limosilactobacillus fermentum, but also Lactococcus lactis, a bacterium found in wine. Finally, we identified several other candidate species (Streptococcus mutans, Mediterraneibacter gnavus, Thomaclavelia ramosa and Enterocloster bolteae), all already known to be pathogenic or associated with human disease. These results were consistent with our literature review, which had identified yeasts (mainly Candida), Lactobacillales (lactic acid bacteria, including Limosilactobacillus), Enterobacteria (notably Klebsiella) and Lachnospiraceae (including Mediterraneibacter and Enterocloster) as the major groups capable of producing ethanol. Our results confirm that ethanol-producing digestive microorganisms can play a key role in NASH. Klebsiella pneumoniae is therefore not the only candidate. In order to identify all candidates for improved diagnosis and management, we have also shown that culturomics and metagenomics are two complementary, non-redundant and essential methods for identifying these key microbes with a view to establishing future diagnostic markers and new therapeutic targets. Key words: nonalcoholic steatohepatitis; intestinal microbiota; intestinal mycobiome; metabolic syndrome; nonalcoholic fatty liver disease; microbial culturomics.