Soutenance de thèse de Andreia MENDES

Le bon fonctionnement du système immunitaire est vital pour maintenir l'équilibre de l'organisme et protéger contre les infections, c'est pourquoi de multiples voies doivent être méticuleusement régulées afin de maintenir l'homéostasie. Une déficience dans la régulation de ce système habile peut le rendre sous-réactif ou surréactif, ce qui rend l'organisme vulnérable et prompt à développer des maladies. Les cellules dendritiques (CD) sont bien établies comme étant le groupe de cellules le plus efficace pour réguler le système immunitaire. Ils forment un réseau moléculaire dans tout le corps, prenant et présentant constamment des antigènes aux cellules T. Selon le microenvironnement, les CDs peuvent promouvoir des mécanismes de tolérance ou activer le système immunitaire adaptatif et déclencher une réponse en cas d'infection par un agent pathogène. Il s'agit d'une reprogrammation globale dans la cellule, à partir des changements dans les modèles d'expression des gènes, le métabolisme, la forme et la synthèse des protéines. L'augmentation de la synthèse protéique fait partie des changements biologiques lors de l'activation, donc sa régulation est une priorité afin de répondre aux exigences du processus de maturation. On a signalé que la réponse des protéines dépliées (RPD) était liée à la réponse immunitaire, et pas seulement en CDs. Ce mécanisme permet de contrer les situations où il y a accumulation de protéines mal pliées dans le réticulum endoplasmique (RE), ce qui entraîne une situation de stress. Elle fait partie d'une réponse intégrée plus générale au stress (RSI), qui répond à tous les changements physiologiques pouvant avoir un impact dans la cellule et qui est centrée sur la régulation de la phosphorylation du facteur d'initiation eucaryote 2α (eIF2α), qui bloque la synthèse protéique. De plus, ce mécanisme cytoprotecteur déclenche un programme spécifique d'expression génique à travers le facteur de transcription ATF4 qui a de multiples cibles. L'un d'eux est le GADD34 qui déclenche une boucle de rétroaction négative en produisant un complexe de déphosphorylation avec la phosphatase PP1 et la G-actine, et rétablit les niveaux d'eIF2α non phosphorylés. Lorsque le stress est trop sévère pour la cellule, ATF4 favorise l'expression de CHOP, une protéine pro-apoptotique. Les résultats préliminaires de notre laboratoire suggèrent que les cellules dendritiques présentent des niveaux sensiblement élevés de phosphorylation eIF2α, ce qui soulève des questions importantes sur son rôle supposé dans la modulation de la fonction immunitaire. En utilisant des CDs Flt3-L, une culture qui imite les CD à l'état d'équilibre de la rate, nous avons montré qu'un niveau élevé de p-eIF2α est acquis pendant le développement de cellules dendritiques in vitro, et est également présent dans les CD splénique à l'état d'équilibre. Néanmoins, en désaccord avec les modèles actuels, ce phénotype ne conduit pas à une arrestation translationnelle globale. De plus, nous avons montré que lors de la détection bactérienne (imitée par la stimulation TLR4 avec LPS), la maturation des CDs nécessite une déphosphorylation eIF2α, afin d'augmenter la synthèse et la maturation des protéines. Nos résultats suggèrent que l'expression de GADD34 est déterminée par la signalisation TLR4 en aval et non par la voie RSI classique. Nous avons utilisé un modèle de souris à élimination conditionnelle pour supprimer spécifiquement la kinase PERK dans les CDs, dont la fonction est la phosphorylation spécifique d'eIF2α pendant l'RPD. Les résultats obtenus suggèrent que les niveaux élevés de p-eIF2α dans les cellules dendritiques à l'état d'équilibre sont partiellement à l'état activé du PERK. Ce phénotype ne semble pas altérer la production de molécules co-stimulantes, ni de cytokines pro-inflammatoires, mais il a une influence sur l'appareil lysosomal et sur la vitesse de migration in vitro.

The well-functioning of the immune system is vital to keep the equilibrium of the body and protect against infections, thus multiple pathways need to be meticulously regulated in order to keep homeostasis. A deficiency in the regulation of this skillful system can make it under-responsive or over-responsive, which makes the body vulnerable and prompt to develop diseases. Dendritic cells (DCs) are well established as the most effective group of cells regulating the immune system. They form molecular network all over the body, constantly uptaking and presenting antigens to T cells. According with the microenvironment, DCs can promote tolerance mechanisms, or activate the adaptive immune system and mount a response in cases of pathogen infection. This involves a global reprogramming in the cell, from changes in gene expression patterns, metabolism, shape and protein synthesis. The increase of protein synthesis is part of the biological changes upon activation, thus its regulation it a priority in order to respond to the demands of the maturation process. The unfolded protein response (UPR), has been reported to be related to the immune response, not only in DCs. This mechanism counteracts the situations where there is an accumulation of unfolded of misfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER), leading to a stress situation. It is part of a more general integrated stress response (ISR), that responds to all the physiological changes that can have an impact in the cell and that is centered in the regulation of the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), that blocks protein synthesis. Furthermore, this cytoprotective mechanism triggers a specific gene expression program through the transcription factor ATF4 that has multiple targets. One of them is GADD34 that triggers a negative feedback-loop by making a dephosphorylation complex with the phosphatase PP1 and G-actin, and restores the levels of non-phosphorylated eIF2α. When the stress is too severe to the cell, ATF4 promotes the expression of CHOP, a pro-apoptotic protein. Preliminary results from our laboratory suggested that dendritic cells display noticeably high levels of the eIF2α phosphorylation, which raised substantial questions about its putative roles in the modulation of the immune function. By using Flt3-L derived DCs, a culture that mimic the steady-state DCs from spleen, we showed that high p-eIF2α is acquired during the development of dendritic cells in vitro, and is also present in steady-state splenic DCs. Nevertheless, in disagreement with the current models, this phenotype doesn’t lead to a global translational arrest. Further, we showed that upon bacterial sensing (mimicked by TLR4 stimulation with LPS), maturation of DCs require eIF2α dephosphorylation, in order to increase protein synthesis and maturate. Our results suggest that the expression of GADD34 is driven by the TLR4 downstream signaling and not by the classical ISR pathway. We used a conditional knockout mouse model to specifically delete the kinase PERK in DCs, whose function is the specific phosphorylation of eIF2α during UPR. The results obtained suggest that the high levels of p-eIF2α in steady-state dendritic cells is partially to the activated status of PERK. This phenotype doesn’t seem to have an impair in the production of co-stimulatory molecules, neither pro-inflammatory cytokines, however it has an influences in the lysosomal machinery and in the speed of migration in vitro.