Soutenance de thèse de Eugénie FOURNIER

L’acide 1-aminocyclopropane carboxylique oxydase (ACCO) est une enzyme à Fe(II) non hémique impliquée dans la biosynthèse de l’éthylène chez les plantes. Notre compréhension du mécanisme ainsi que du rôle des différents cofacteurs nécessite l’obtention des données structurales précises et des informations sur la dynamique de la protéine. Une structure cristallographique a été publiée montrant la partie C-terminale (C-term) éloignée du site actif. Ce n’est probablement pas la conformation active car il a été montré que la partie C-term est essentielle à l’activité de l’enzyme. Un modèle structural a été construit dans lequel la partie C-term est tournée vers le site actif. Différentes conformations semblent donc possibles, suggérant une dynamique de la partie C-term. Le marquage de spin couplé à la spectroscopie RPE est une technique puissante pour sonder la dynamique structurale des protéines. Elle implique la liaison covalente de sondes paramagnétiques (nitroxydes) sur des acides aminés notamment des cystéines. Il est alors possible d’analyser la mobilité des sondes pour obtenir des informations sur leur environnement local. Par l’utilisation de techniques de RPE avancées, des mesures de distances entre deux sondes sont possibles. Des mutants portant une ou deux cystéines ont été conçus, exprimés, purifiés et caractérisés. La dynamique des mutants marqués a été étudiée in vitro par RPE en onde continue. Par l’utilisation de la RPE impulsionnelle, des distances ont été mesurées pour l’ACCO en solution en présence de différentes combinaisons de cofacteurs. Les distances expérimentales ont été comparées à celles prédites à partir des structures cristallographiques et du modèle structural et aussi à celles obtenues par des calculs de dynamique moléculaire. Des données structurales préliminaires par RPE in cell sont également présentées. Pour cibler d’autres positions sur la séquence de l’ACCO, l’introduction d’un acide aminé non naturel a été réalisée avec succès permettant d’obtenir de premières données structurales par spectroscopie RPE.

1-aminocycloproprane carboxylic acid oxidase (ACCO) is a non-heme iron(II) containing enzyme involved in the biosynthesis of ethylene in plants. ACCO reaction mechanism and the role of the various cofactors are not well understood and structural and dynamic data are still required. A crystallographic structure has been reported showing the C-terminal part (C-term) away from the active site. This might not be the active conformation as it has been shown that the C-term is essential for activity. Later, a structural model has been proposed in which the C-term is folded towards the active site. Different conformations can be hypothesized suggesting a dynamic role of the C-term. A technique well suited to monitor protein dynamics is site-directed spin labeling followed by EPR spectroscopy. It relies on the covalent insertion of a paramagnetic nitroxide derivative on residues such as cysteines. Using this approach, it is possible to analyze the mobility of the label in order to obtain information on its local environment. Moreover using advanced EPR techniques, it is possible to acquire interspin distances between two incorporated probes. Mutants bearing one or two cysteines at desirable positions were designed, expressed, purified and characterized. The dynamics of labeled mutants were studied in vitro using continuous wave EPR. By the use of pulsed EPR, distances were recorded for ACCO in solution in presence of different combinations of cofactors. The experimental distances were compared to the predicted ones obtained from the crystallographic and model structures, and also to the calculated ones obtained by molecular dynamic simulations. The achievement of preliminary structural data by in cell EPR are also presented. A successful introduction of an unnatural amino acid onto the sequence of ACCO was performed, allowing to obtain earliest results by EPR spectroscopy.