Soutenance de thèse de EVE PLAYOUST

Les lymphocytes B infiltrant les tumeurs solides (TIL-B) sont fréquents dans les échantillons tumoraux de patients et leur degré d’infiltration a un rôle pronostic favorable pour l’évolution clinique des patients. Ils peuvent être dispersés ou regroupés sous la forme de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) qui sont des formations lymphoïdes ectopiques retrouvées à distance des organes lymphoïdes secondaires (SLO) conventionnels. Certains TLS, considérés comme matures (mTLS), présentent un degré d’organisation supplémentaire et contiennent des structures similaires à des centres germinatifs (GC). Récemment, la présence de ces GC-TLS a été associée à de meilleurs taux de réponses aux inhibiteurs de points de contrôles immunitaires (ICI). Les plasmocytes intra-tumoraux (TIL-PC) ont également été associés à une meilleure réponse des patients atteints de tumeurs du poumon (PATP) traités par anti PD-1/PDL-1. Si le rôle pronostic des TIL-B est aujourd’hui connu, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette conséquence clinique demeure manquante. Caractériser les TIL-B est un premier levier de compréhension indispensable pour potentiellement les cibler dans des approches thérapeutiques futures. Ainsi, la caractérisation précise de leur organisation spatiale, l’étude de leurs expansions clonales et de leur répertoire immunitaire, ou la compréhension de leurs spécificités antigéniques sont des aspects clés du travail de recherche présenté dans ce manuscrit de thèse. Une question biologique à l’échelle du microenvironnement tumoral (MT) a notamment animé ce travail de recherche : les TIL-PC sont-ils en majorité exportés localement de GC-TLS à la manière de ce qui est observé dans les SLO ? Notre projet de caractérisation des TIL-B repose sur l’utilisation de techniques intégratives sur la base d’une collaboration entre l’équipe de recherche du Dr Milpied au CIML et la société de biotechnologies Innate Pharma avec le Pr Vivier et le Dr Remark. Ce travail est également partenaire du projet PIONeeR. Les échantillons de PATP ont été analysés à l’aide de techniques de génomique (single cell et bulk RNA seq, transcriptomique spatiale, séquençage de BCR à partir de transcriptomique spatiale) ainsi qu’en imagerie en immunofluorescence multiplex. L’analyse spatiale des TIL-B sur 13 tumeurs du poumon a montré qu’une proportion faible des TLS sont matures. Les densités les plus importantes des sous types B naïfs, mémoires, et du GC sont retrouvés dans les TLS alors que les densités les plus importantes de TIL-PC d’isotype IgG ou IgA sont retrouvées dans le stroma, indépendamment de la présence de TLS. L’analyse spatiale des transcrits d’immunoglobulines de 4 tumeurs a confirmé une prépondérance des TIL-PC à infiltrer le stroma des tumeurs. Les diversifications clonales des TIL-B présentent un mécanisme différent de ce qui est observé pour les LB dans les SLO où la réaction du centre germinatif est le mode d’expansion clonale le plus fréquent. Notre analyse des répertoires immunitaires des TIL-B a montré que la majorité des TIL-PC sont issus de la différenciation in situ de LB mémoires réactivés, tandis qu’une proportion mineure est exportée des GC-TLS. Notre projet a permis de démontrer que des TIL-B sont capables de circuler dans le sang périphérique de patients sous la forme de plasmablastes ou de LB mémoires. Notre équipe a montré une réactivité fréquente des TIL-B contre des antigènes du soi, qui peut être préexistante ou acquise via un processus de maturation d’affinité. Partenaires du projet PIONeeR, nous évaluons si les densités des différents sous-types de TIL-B ainsi que leur organisation sous la forme de TLS ou de GC-TLS peuvent être des biomarqueurs (BM) robustes de survie ou de réponse aux anti PD-1/ anti PD-L1 pour les PATP. Ce projet ouvre comme perspective une médecine personnalisée basée sur des BM ainsi que le développement d’immunothérapies activant les réponses B intra-tumorales telles que les réponses des GC-TLS.

Tumor infiltrating B lymphocytes (TIL-B) are frequently found within solid tumors and are of good prognosis in many indications such as lung tumors. They frequently form tertiary lymphoid structures (TLS) that sometimes contain germinal center-like structures (GC-TLS) that ressemble secondary lymphoid organ germinal centers. Recently, the presence of these GC-TLS has been associated with better response rates to immune checkpoint inhibitor (ICI) treatments. This is also the case for intratumoral plasma cells (TIL-PC) that have been associated to better survival rates upon anti PD-1/PDL-1 treatment. Although TIL-B positive prognostic impacts are now known, the understanding of the mechanisms driving those clinical impacts is still lacking. Characterizing TIL-B in patient tumors samples is an essential first level of understanding to target them later on with new therapeutic approaches. Thus, the work presented here is focusing on TIL-B spatial organization, clonal expansions and immune repertoires, and antigenic specificities. A major task of our work aims at understanding whether plasma cells found in patient tumor samples are mostly exported from local GC-TLS similar to what is observed for plasma cell differenciation in secondary lymphoid organs. To characterize TIL-B, our project relies on the use of integrative techniques allowed by a collaboration between the research team of Dr. Pierre Milpied at the CIML and the biotechnology company Innate Pharma with Pr Vivier and Dr Remark. Our work is also part of the PIONeeR clinical trial project. Patient with lung tumor samples were analyzed using genomics techniques (single cell and bulk RNA seq, spatial transcriptomics, BCR sequencing from spatial transcriptomics data) as well as multiplex immunofluorescence imaging. Spatial analyses of 13 tumor samples revealed that tumor infiltrating naive B cell, memory B cells and GC B cells reside mostly in TLS, whereas TIL-PC are mostly located in the stroma, at distance from TLS. Tracking BCR sequences in tumors with spatial BCR-seq confirmed that TIL-PC are mostly infiltrating tumors stroma. We found that TIL-B clonal diversifications patterns showed major differences from germinal center dependant clonal diversifications frequently observed in secondary lymphoid organs. Indeed, TIL-B clonotype tracking suggested poor TIL-PC output from TIL-GC, but frequent TIL-PC differentiation from in situ reactivation of TIL-Bmem. We tracked TIL-B clonotypes among single blood plasmablasts, suggesting TIL-PC may transit through the blood from or to the tumor site. Our team has shown a frequent TIL-B reactivity against self-antigens, which can be pre-existing or acquired through affinity maturation. Within the PIONeeR research project partnership, we are testing whether TIL-B subtype densities and TLS or mTLS organization are robust biomarkers of survival or response to anti PD-1/ anti PD-L1 treatments for patients with lung tumors. This project opens up the prospect of personalized medicine based on biomarkers as well as the development of tailored TIL-B immunotherapies activating intra-tumoral TIL-B responses such as GC-TLS responses