Soutenance de thèse de Alice DECOMBE

Les étapes précoces de l’infection par le VIH-1, jouent un rôle clé dans la capacité du virus à s’intégrer dans le génome des cellules cibles. En ce sens, le virus est capable d’échapper à la réponse antivirale précoce médiée par les récepteurs et effecteurs de l’immunité innée. Notamment, le VIH recrute une 2′-O-méthyltransférase cellulaire, nommée FTSJ3, qui dépose au moins 17 2′-O-méthylations internes sur son ARN génomique viral. Les 2′-O-méthylations limitent la détection des ARN par le récepteur de l’immunité MDA5, inhibant la réponse IFN de type 1. Les 2′-O-méthylations limitent également l’activité de l’exonucléase cellulaire ISG20. Les 2′-O-méthylations jouent ainsi des rôles proviraux. Toutefois, l’impact des 2′-O-méthylations sur l’étape de rétrotranscription du VIH n’était pas documenté. Or, cette étape implique une interaction critique entre l’ARN viral 2′-O-méthylé et la rétrotranscriptase du VIH. Ainsi, ce projet de thèse vise à mieux comprendre le rôle joué par les 2′-O-méthylations du génome viral sur cette étape de la réplication virale. Nous avons testé la rétrotranscription endogène sur des virus issus de cellules WT ou FTSJ3-KO d’une part, et la réplication virale en infectant des cellules avec ces deux types de virus d’autre part (qui sont donc méthylés ou hypo-méthylés). Lorsque les virions sont produits en cellules FTSJ3-KO, la transcription inverse et la réplication virale, quantifiées par qPCR, ont des rendements plus élevés en comparaison avec les virus issus de cellules WT. Cela suggère un effet antiviral des 2′-O-méthylations. Cet effet est confirmé dans des expériences d’extension d’amorce ADN, à partir d’une matrice ARN 2′-O-méthylée ou non sur un site unique, avec la polymérase purifiée du VIH-1. La polymérase virale marque une pause avant le site méthylé, à l’instar d’autres polymérases rétrovirales, pour de faibles concentrations en dNTP, mimant celles retrouvées dans les macrophages ou les cellules quiescentes. Des analyses cinétiques et structurales ont permis de caractériser les mécanismes expliquant l’inhibition de la rétrotranscription causée par les 2′-O-méthylations. En conclusion, il y aurait un compromis entre les effets proviraux des 2′-O-méthylations (le génome viral est indétectable et résistant à la dégradation) et les effets antiviraux (la rétrotranscription est limitée), suggérant une régulation fine de l’ajout de ces marques épitranscriptomiques au cours du cycle viral. Aussi, ces travaux de thèse apportent la preuve du potentiel antiviral des 2′-O-méthylations, et questionnent le rôle de facteur de restriction des 2′-O-méthyltransférases cellulaires, ouvrant la voie à des recherches similaires sur d’autres virus à ARN.

The early stages of HIV infection are of critical importance to ensure the integration of the viral genome into the DNA of target cells, and establish a persistent infection. Recently, HIV-1 has been shown to escape from the immune detection by recruiting a cellular 2′-O-methyltransferase, called FTSJ3, that methylates 17 internal sites of the viral RNA genome. These epitranscriptomic modifications prevent the detection of the viral RNA genome by the receptor MDA5, and consequently limit the production of type 1 IFN. 2′-O-methylations also inhibit the exonuclease activity of ISG20. Altogether, FTSJ3-induced methylations play proviral roles during HIV-1 replication. However, little is known about the role played by 2′-O-methylations on other steps of the replication, such as retrotranscription. This thesis project aims at better understanding whether 2′-O-methylations affect the interactions between the HIV reverse transcriptase and the viral RNA genome. We tested this hypothesis by endogenous reverse transcription on viruses coming from WT versus FTSJ3-KO cells, and viral infection in immune cells with both types of virions (i.e. methylated or hypo-methylated). Quantification of reverse transcription and viral replication by qPCR shows that virions originating from FTSJ3-KO yield higher loads of reverse-transcribed products. It suggests that 2′-O-methylations exert an antiviral effect on retrotranscription. To go further, we performed primer extension assays, on a DNA/RNA primer/template duplex, with the purified HIV-1 polymerase. These assays demonstrate that a single 2′-O-methyl on an RNA template causes the polymerase to stall during reverse transcription, just before the methylated site, at low dNTP concentrations. It is reminiscent to what was found for other retroviral polymerases. Kinetic and structural analysis allowed to characterize the mechanisms explaining how 2′-O-methylations limit reverse transcription. As a conclusion, there is a trade-off between proviral effects (i.e. the viral genome is undetectable and resistant to degradation) and antiviral effects (i.e. retrotranscription is limited) caused by 2′-O-methylations, suggesting a fine tuning of methyl addition during viral replication. Eventually, this work not only evidences the potential antiviral role of 2′-O-methylations, but also question the role of restriction factor played by cellular 2′-O-methyltransferases, paving the way for similar research on other RNA viruses.