Soutenance de thèse de Karoline FRIEDL

La microscopie à fluorescence est aujourd'hui l'un des outils les plus précieux en biologie cellulaire. L'imagerie à haute résolution et le marquage spécifique permettent d'étudier l'intégrité structurelle des cellules dans la santé et la maladie. L'imagerie en canaux multiples permet d'étudier plus en détail l'interaction fine des compartiments et des structures à l'intérieur du corps cellulaire. Pour une résolution plus élevée, la barrière de diffraction de la microscopie optique doit être brisée. Le concept brillant de la microscopie à localisation de molécules uniques (SMLM) a permis de surmonter cette barrière par la séparation stochastique des émetteurs dans le temps, et le post-traitement des données pour localiser les positions de tous les émetteurs avec une précision inférieure à la diffraction. La première partie de cette thèse détaille deux travaux auxquels j'ai participé et qui ont apporté des avancées pour SMLM. Nous décrivons notre routine optimisée pour acquérir des images super-résolues avec SMLM dans Jimenez et al. (2020) avec Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) et DNA-Point accumulation for imaging in nanoscale topography (DNA-PAINT). La publication retrace les étapes de la procédure de préparation de l'échantillon, en passant par les paramètres d'imagerie sur nos configurations de microscopie SMLM jusqu'aux performances des différents algorithmes de post-traitement. Dans Mau et al. (2021), nous décrivons l'Adaptable Scanning for Tunable Excitation Regions (ASTER), un schéma d'illumination basé sur un laser à balayage plutôt que sur l'expansion d'un faisceau gaussien. La nature du balayage de l'excitation permet une excitation uniforme sur de larges champs d’intérêt. La partie principale de cette thèse se concentre sur l'implémentation et l'optimisation d'approches SMLM multi-couleurs rapides et robustes. En microscopie à fluorescence limitée par la diffraction, la séparation des canaux est réalisée par des marqueurs fluorescents de différentes longueurs d'onde ; pour la SMLM, le choix de fluorophores appropriés ou de sondes distinguables (séquences de brins d'ADN appropriées pour le DNA-PAINT) limite les canaux disponibles. Dans Friedl et al. (en préparation), nous détaillons deux mises en œuvre de l'acquisition multicanaux pour l'imagerie SMLM : une approche bicolore simultanée de DNA-PAINT pour l'imagerie avec deux colorants séparables, et une approche de spectral demixing utilisant deux fluorophores rouges profonds compatibles avec STORM et DNA-PAINT. Ces approches SMLM multicanaux ont été appliquées dans deux collaborations sur la plasticité du corps cellulaire neuronal en relation avec le cytosquelette. De plus, j'ai participé à deux projets qui ont bénéficié du SMLM multicanal, où nous avons étudié le mécanisme de réparation des microtubules (Gazzola et al., sous presse) et les sous-structures d'actine dans la présynapse (Bingham et al., 2022).

Fluorescence microscopy is nowadays one of the most valuable tools in cell biology, imaging with high resolution and specific labeling allow for studying the structural integrity of cells in health and disease. Imaging in multiple channels permits further studying the fine interaction of compartments and structures inside the cellular body. For nanometric resolution, the diffraction barrier of light microscopy must be broken. The brilliant concept of Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) has made it possible to overcome this barrier by stochastic separation of the emitters in time, and postprocessing the data to localize the positions of all emitters with sub-diffraction precision. The first part of this thesis details two works I participated in that brought advances for SMLM. We describe our optimized routine to acquire super-resolved images with SMLM in Jimenez et al. (2020) with Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) and DNA-Point accumulation for imaging in nanoscale topography (DNA-PAINT). The publication traces the steps from the sample preparation procedure, over the imaging parameters on our SMLM microscopy setups to the performance of different post-processing algorithms. In Mau et al. (2021) we describe Adaptable Scanning for Tunable Excitation Regions (ASTER), an illumination scheme that bases on a scanning laser rather than expanding a Gaussian beam. The scanning nature of the excitation allows for uniform excitation over large fields of view. The main part of this thesis is focused on implementing and optimizing fast and robust multi-color SMLM approaches. In diffraction-limited fluorescence microscopy, the separation of channels is achieved by fluorescent labels of different wavelengths; for SMLM the choice of suitable fluorophores or distinguishable probes (suitable DNA strand sequences for DNA-PAINT) limits the available channels. In Friedl et al. (in preparation), we detail two implementations of multi-channel acquisition for SMLM imaging: a simultaneous two-color DNA-PAINT approach for imaging with two separable dyes, and a spectral demixing approach using two far-red fluorophores compatible with STORM and DNA-PAINT. These multi-channel SMLM approaches were applied in two collaborations about the plasticity of the neuronal cell body in relation to the cytoskeleton. Furthermore, I participated in two projects that benefited from multi-channel SMLM, where we investigated the microtubule repair mechanism (Gazzola et al., in press) and actin sub-structures in the presynapse (Bingham et al., 2022).