Soutenance de thèse de Baptiste BROC

L’adressage de principes actifs vers des organes cibles est un enjeu majeur de l’industrie pharmaceutique. En effet les molécules d’intérêt thérapeutiques de type « biomolécules » (protéines, anticorps, oligonucléotides, peptides, etc.) représentent une part de plus en plus importante de l’ensemble des candidats-médicaments évalués par rapport aux molécules thérapeutiques classiques issues de la synthèse organique. Ces biomolécules sont, par leur nature même, incapables de franchir les barrières biologiques. Ainsi ces nouvelles formes de principes actifs nécessitent le développement de stratégies de délivrance spécifiques qui leur permettent d’atteindre leur cible et ainsi d’obtenir l’effet thérapeutique escompté, en limitant les effets secondaires. Parmi les produits biologiques, les petits ARN interférents (siARNs) font partie des agents thérapeutiques les plus prometteurs en raison de leur spécificité et de leur capacité à moduler l'expression des maladies liées aux gènes. Tout gène d'intérêt peut être potentiellement régulé à la baisse, faisant de la technologie basée sur l'interférence de l’ARN la percée de notre époque dans le domaine de la santé. Cependant, la délivrance fonctionnelle et spécifique des siARNs dans les tissus d'intérêt et dans le cytosol des cellules cibles reste très difficile, principalement en raison du manque de systèmes de délivrance efficaces et sélectifs. Parmi la variété de supports pour la délivrance de siARN, les peptides sont des candidats essentiels en raison de leur grande sélectivité, de leur faible coût de production, et de leur stabilité et versatilité de conjugaison. L'objectif de la thèse, à l'interface de la chimie et de la biologie, était de développer des conjugués moléculaires comprenant des siARNs liés de manière covalente à des peptide vecteurs ciblant le récepteur au LDL (LDLR), et d'évaluer l'efficacité d’extinction des conjugués sur différents ARNm dans le but d’un adressage spécifique vers les tissus enrichis en ce récepteur, par exemple le cerveau ou les tumeurs. Dans un premier temps, a été mise au point la synthèse des conjugués peptide-siARN en utilisant un siGFP comme siARN modèle. Sur la base de ce travail préliminaire avec l'ARNm GFP comme cible, le design des conjugués a été exploré et a permis de développer les outils de synthèse et d’évaluation pour ce projet. Dans un second temps, les peptides vecteurs ciblant le LDLR ont ensuite été conjugués à des siARN ciblant le gène SOD1, une protéine ubiquitaire présentant l’avantage permettre d’évaluer à travers ces conjugués la biodistribution des conjugués. Cette thèse a fait appel à la synthèse organique, la synthèse peptidique, la chimie de bioconjugaison afin de générer différents conjugués siARN-vecteur peptidique ciblant le LDLR, mais aussi pour l’évaluation des conjugués à des techniques de biochimie, des études physico-chimiques par SPR, des tests in vitro sur des modèles cellulaires et des tests in vivo sur des modèles animaux. Dans cette thèse nous validons l’utilisation d’un peptide cyclique affin pour le LDLR, comme ligand capable d’induire la délivrance fonctionnelle d’oligonucléotide à la fois dans un modèle cellulaire de neuroblastome et après administration systémique in vivo dans des souris, avec une réduction de 50% de l’ARNm cible. Etant donné que le LDLR offre, au-delà du foie, un certain degré de sélectivité tissulaire et est surexprimé dans de nombreux cancers, le travail présenté ici ouvre de nouvelles opportunités pour la délivrance de siARNs thérapeutiques dans des tissus extrahepatiques ou dans des tumeurs, qui autrement ne seraient pas accessibles avec des oligonucléotides nus.

Delivery of active principles to diseased organs is a major challenge for the pharmaceutical industry. The proportion of biologics (such as proteins, antibodies, oligonucleotides, peptides) among all drug candidates is continuously growing when compared to classic small organic drugs. Biomolecules have intrinsic limitations since they are unable by nature to cross biological membranes. Delivery strategies are warranted for these new types of active principles, in order to increase their tissue, cellular delivery, therapeutic effect while limiting off-target effects. Among biologics, small interfering RNAs (siRNAs) have become one of the most promising therapeutic agents because of their specificity and their potential to modulate the expression of gene-related diseases. Any gene of interest can be potentially down-regulated, making RNA-based technology the healthcare breakthrough of our era. However, the functional and specific delivery of siRNAs into tissues of interest and into the cytosol of target cells remains highly challenging, mainly due to the lack of efficient and selective delivery systems. Among the variety of carriers for siRNA delivery, peptides have become essential candidates because of their high selectivity, stability and conjugation versatility. The objective of the thesis, at the interface of chemistry and biology, was to develop molecules encompassing siRNAs conjugated to “peptide vectors” optimized in house, that target the LDLR, and to evaluate the knock down efficiency of the conjugates on different mRNAs. We first developed our proof of concept by conjugating siRNAs that target GFP expressed in stable cell lines. Based on this preliminary work with GFP mRNA as the target, the LDLR-peptide-vectors were further conjugated to siRNAs targeting mRNAs encoding SOD1, a ubiquitous protein physiologically expressed in vitro and in vivo. We used organic synthesis, peptide synthesis, bioconjugation chemistry to generate several siRNA-peptide vector conjugates targeting the LDLR, but also biochemical techniques, physicochemical studies by SPR, in vitro tests on cell models and in vivo tests on animal models to evaluate the impact of different parameters on the efficacy of the conjugates and to optimize them step by step. Here, we validate the previously described synthetic LDLR-binding peptides, including the VH4127 peptide, as viable ligands able to trigger efficient LDLR-mediated functional delivery of therapeutic oligonucleotides both in a cellular model of neuroblastoma and in vivo after systemic administration in mice, with a 50% reduction in target mRNA levels. Since the LDLR presents some degree of tissue selectivity, beyond the liver, and is overexpressed in many cancers, the present work opens new opportunities and warrants further evaluation for delivery to either extrahepatic sites or in tumors that otherwise do not support functional uptake of naked oligonucleotides.