Soutenance de thèse de Boris TAILLEFER

Le système de sécrétion de type VI (SST6) est une nano machine utilisée par les bactéries pour se battre entre elles afin envahir une niche ou un hôte. Le SST6 est un complexe multiprotéique qui s’assemble et se contracte comme un harpon en propulsant une flèche chargée de toxines. La structure et les fonctions générales du SST6 sont maintenant bien connues. La régulation du SST6 est parfois complexe avec différentes modalités, constitutive ou hautement régulée, sans que la raison de cette régulation soit bien comprise. Chez la souche modèle E. coli entéro-agrégatif (EAEC), le promoteur du cluster de gène encodant le SST6-1 (Psci1) est composé de deux boîtes Fur (F1 et F2) et de trois sites cibles de la méthyltransférase Dam (sites GATC, G1, G2 et G3). L’expression de Psci1 est donc sensible à la carence en fer à travers la répression par Fur en compétition avec la méthylation par Dam. Le SST6-1 pourrait jouer un rôle dans la colonisation de l’intestin hôte en entrant en compétition avec la flore commensale. Ce travail de thèse a pour objectif de poursuivre la caractérisation des fonctions du SST6 par trois approches différentes. Premièrement, nous avons exploré la régulation du SST6-1 qui produit une hétérogénéité phénotypique d’expression dans un population clonale. En utilisant des rapporteurs fluorescents et des approches de cellule unique, nous avons montré que l’expression hétérogène du SST6 produit deux sous-populations (ON et OFF) à l’équilibre pendant plusieurs générations. Nous avons déterminé que Fur, Dam et l’architecture du promoteur étaient responsables de cette expression hétérogène puisque les mutations des sites F2 et G3 produisent une expression homogène ON ou OFF, respectivement. En utilisant des mélanges artificiels de sous-populations, nous suggérons que l’expression hétérogène permet à la fois d’éliminer des bactéries rivales tout en permettant une meilleure survie de la population contre une bactérie défensive. Nous proposons que l’hétérogénéité du SST6 chez EAEC répond donc à un compromis entre tuer efficacement et survivre dans un environnement polymicrobien. Deuxièmement, nous avons exploré les bases moléculaires du SST6 à travers une évolution expérimentale. Pour cela, nous avons fait évoluer EAEC avec (EP) ou sans (E) proie. Après 640 générations, près de 90% des clones de la population ayant évolué sans proie ont perdu leur activité antibactérienne. Le séquençage du génome de 16 clones a permis de détecter des mutations dans le SST6 (promoteur, tssM, tssF and tssK) responsables de son inactivation, mais également dans les gènes csgE et rfaH. La caractérisation de ses mutations a permis de mettre en évidence que l’anti-terminateur de la transcription RfaH régulait la transcription du SST6-1 grâce à deux éléments ops présent dans le cluster sci1. Cette évolution expérimentale a donc permis de mieux caractériser les interactions entre les protéines du SST6 et de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans sa fonction. Troisièmement, je me suis proposé d’étudier l’évolution de l’expression hétérogène du SST6. En utilisant une approche bio-informatique, j’ai détecté des variations de séquence de Psci1 dans la diversité des E. coli pathogènes. J’ai trouvé que F2 était hautement variable et que certaines souches avaient un site GATC additionnel (G4), suggérant que ces variations pourrait déplacer l’équilibre de l’hétérogénéité. J’ai donc reproduit ces deux variations dans le fond génétique de EAEC, ce qui m’a permis de montrer que le site G4 additionnel est responsable d’une activation plus rapide et plus forte de Psci1, alors que deux mutations dans la boite F2 et dans l’environnement de G2 diminuent légèrement la fraction de la sous-population ON. Ces résultats suggèrent que l’hétérogénéité d’expression du SST6 a été sélectionné par l’évolution et que son équilibre pourrait être critique pour l’adaptation.

The type VI secretion system (T6SS) is a bacterial nanoweapon used by bacteria to compete with other bacteria for a niche or to invade a host. The T6SS is a multiprotein complex that assembles and contracts as a nanospeargun to propel a needle loaded with deadly toxins. The general structure and functions of T6SSs are now well known. Its regulation is strain-specific and sometimes complex with different modalities such as a constitutive or regulated, though the purpose for these regulations is not understood. In the bacterial model enteroaggregative Escherichia coli (EAEC), the T6SS-1 promoter (Psci1) is composed of two Fur boxes (F1 and F2) and three Dam target sites (GATC sites, G1, G2 and G3). Psci1 expression is responsive to iron levels through Fur repression in competition with Dam-dependent methylation. T6SS-1 is thought to play a role in the human gut colonization by competing with commensal bacteria. This thesis work aimed to further characterize the T6SS functions through three independent approaches. First, we explored T6SS-1 regulation, which produces a phenotypic heterogeneity of expression in a clonal population. Using fluorescent reporters and single-cell approaches, we showed that the T6SS heterogeneous expression produces two subpopulations (ON and OFF) which are at equilibrium through several generations. We determined that Fur, Dam and the promoter architecture are responsible for this heterogeneous expression, as the mutation of the F2 or G3 sites led to a homogeneous ON or OFF expression, respectively. Using artificial mixed subpopulations, we suggest that a heterogeneous expression allows to eliminate susceptible target cells and to increase the population survival against T6SS defensive bacteria. We propose that the T6SS phenotypic heterogeneity in EAEC answers a trade-off between killing efficiency and survival in a polymicrobial environment. Second, we explored the molecular basis of the through an experimental evolution approach. For this, we evolved EAEC in the presence (EP) or absence € of a susceptible prey. After 640 generations we found that about 90% of the clones evolved without prey lost the T6SS antibacterial activity. Whole genome sequencing of 16 selected clones identified mutations within the T6SS gene cluster (promoter, tssM, tssF and tssK) that abolish or reduce T6SS activity, and mutations in the csgE and rfaH genes. The characterization of these mutations revealed that the anti-terminator of the transcription RfaH regulates T6SS-1 transcription thanks to two ops binding sites in the sci1 cluster. This experimental evolution approach therefore allowed to further characterize the T6SS protein interaction network and to discover new regulators of its function. Third, I decided to unify the two first projects by studying the evolution of the T6SS heterogeneous expression. Using a bioinformatic approach, I detected sequence variations in the T6SS promoter of pathogenic E. coli strains. I found that the F2 site is highly variable and detected strains with an additional distal GATC site (G4), suggesting that these elements may displace the subpopulation equilibrium. I thus reproduced two mutations in the EAEC background and observed that an additional G4 increased the speed and the strength of Psci1 activation, whereas two SNPs in the F2 site and in the G2 environment led to a slight decrease in the ON subpopulation. These results suggest that heterogeneity has been selected by the evolution and that the heterogeneous equilibrium might be critical for adaptation.