Soutenance de thèse de Melanie ROSSOTTI

Le cuivre est un microélément essentiel puisqu’il participe à de nombreux processus cellulaires mais peut également être une arme cytotoxique s’il se retrouve dans des concentrations supérieures aux besoins cellulaires. Il est donc nécessaire et vital pour les organismes de contrôler sa concentration cellulaire. CopI est une protéine de 15 kDa qui a été identifiée chez une protéobactérie pourpre photosynthétique, Rubrivivax gelatinosus. Cet organisme est dépourvu du mécanisme, bien connu, de résistance au cuivre qui implique la cuivre oxydase CueO et le système d’export CusCFBA et a donc développé un nouveau mécanisme de résistance. Il a été montré que CopI est directement impliquée dans ce nouveau mécanisme. Elle est également retrouvée dans des bactéries pathogènes pour l’Homme comme Vibrio cholerae, qui comme R. gelatinosus ne possède pas le système de résistance classique, et Pseudomonas aeruginosa, qui possède les deux systèmes. Il a été montré que cette protéine appartient à la famille des cuprédoxines et peut fixer trois ions Cu(II) dans : un site cuprédoxine, un site N-terminal de géométrie plan-carrée et un site supposé localisé dans une région très conservée riche en histidines et méthionines. La délétion du site cuprédoxine ou du site His/Met induit la perte de la résistance au cuivre tandis que la délétion du site N-terminal n’a pas d’effet. Cependant le mécanisme d’action et la structure de cette protéine ne sont pas connus. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la fixation du Cu(I) et du Cu(II) à la protéine sauvage et à différents mutants et les transferts d’électron possibles. Mes résultats suggèrent que CopI joue un rôle dans l’oxydation du Cu(I) périplasmique très toxique. Je me suis également attelée à la détermination de la structure en solution de CopI par RMN ainsi qu’à l’étude de la géométrie locale du site cuprédoxine par des techniques avancées de spectroscopie RPE.

Copper is an essential microelement as it participates in many cellular processes but can also be a cytotoxic weapon if found in concentrations higher than the cellular needs. It is therefore necessary and vital for organisms to control its cellular concentration. CopI is a 15 kDa protein that was identified in a photosynthetic purple proteobacterium, Rubrivivax gelatinosus. This organism lacks the well-known copper resistance mechanism involving the copper oxidase CueO and the export system CusCFBA and therefore has developed a new resistance mechanism. It was shown that CopI is directly involved in this new mechanism. CopI is also found in human pathogenic bacteria such as Vibrio cholerae, which also lacks the classical resistance system, and Pseudomonas aeruginosa, which has both systems. It has been shown that this protein belongs to the cupredoxin family and can bind up to three Cu(II) ions in: a cupredoxin site, a N-terminal site with square-planar geometry and a site assumed to be located in the highly conserved histidine/methionine rich region. The deletion of the cupredoxin or the His/Met site induces the loss of copper resistance in the bacterium while the deletion of the N-terminal site has no effect. However, the mechanism of action and the structure of the protein remain unknown. During my PhD, I studied the Cu(II) and Cu(I) binding on the native protein and different mutants and the possible electron transfers. My results suggest that CopI plays a role in the oxidation of periplasmic Cu(I). I have also worked on determining the structure of CopI in solution by NMR as well as studied the local geometry of the cupredoxin site by advanced EPR spectroscopy techniques.