Soutenance de thèse de Charlotte LEQUEUE

En immunothérapie des cancers, le blocage des signaux co-inhibiteurs des cellules T (comme les récepteurs CTLA-4 et PD-1) ont démontré un bénéfice de survie significatif. De plus, les cellules T Vγ9Vδ2, une sous-famille des cellules T possédant une capacité cytolytique, ont émerge comme une nouvelle immunothérapie. Dans le sang périphérique, la majorité des T γδ retrouvés (50 à 95%) sont des cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules sont activées par des phosphoantigènes (Pags). Pags sont présentés aux T γδ par une protéine de co-stimulation immune BTN3A (membre 3 de la sous famille butyrophiline) provenant de la famille B7. La sous famille BTN3A incluse trois membres : BTN3A1, A2 et A3. Le membre BTN3A2, qui est dépourvu du domaine intracellulaire fonctionnel, est surexprimé dans quatre cancers (pancréas, gastrique, leucémie myéloïde aigu et de l’ovaire) et pourrait agir comme récepteur leurre. Notre objectif était d’identifier le ligand de BTN3A2, qui pourrait être utile pour mettre en place une stratégie thérapeutique. Premièrement, les études de liaison par cytométrie en flux conduit à la sélection de quelques lignées cellulaire T exprimant le ligand de BTN3A2. Puis, la comparaison du profil d’expression génique (puce Agilent) des trois lignées positives et des deux lignées négatives (concernant la liaison de BTN3A2) permet d’établir une liste de protéines membranaires exprimées seulement dans les lignées cellulaires positives. Celles-ci pourraient représenter les candidats du ligand de BTN3A2. Les hauts Fold Change (FC) ont été trouvés pour les molécules HLA de classe II. De plus, la technologie de puce cellulaire Retrogenix a été utilisée pour identifier les récepteurs partenaire potentiels de BTN3A2. Les quatre produits géniques restants ont été sélectionnés, PLPP3, SEMA6A, SEMA6C et MSR1. Après génération de lignées cellulaire HEK 293T surexprimant les candidats potentiels de transcriptomique et Retrogenix, ces cellules ont été utilisées pour des essais de liaison avec BTN3A2-Fc. Ces essais sont négatifs dans les différentes conditions. Finalement, les expériences (permettant de détecter des biomarqueurs) ont été effectuées pour isoler et identifier, par spectrométrie de masse, le ligand de BTN3A2. Nous avons utilisé un agent de capture original (TFR) avec trois bras, permettant une liaison covalente, qui a montré clairement que BTN3A1 était le candidat potentiel. Nous avons conclu que BTN3A1/BTN3A2 formé un hétérodimère. Cette étude confirme l’hétérodimérisation de BTN3A1/A2 and nous montre l’importance de cette forme pour reconnaitre son ligand. De plus, la protéine MSR1 (candidat de la méthode Retrogenix) et ABCA12 (candidat de la méthode transcriptomique) semblent faire partie du complexe d’activation des cellules T Vγ9Vδ2.

In cancer immunotherapy, the blocking of T-cell co-inhibitory signals (such as CTLA-4 and PD-1) demonstrated significant survival benefit. Moreover, Vγ9Vδ2 T cells, a subfamily of T cell propertied cytolytic capacity, emerged as new immunotherapy. These T cells are the majority of peripheral blood (with 50 to 90%) and are activated by phosphoantigens (Pags). Pags are presented to γδ T cells by immune costimulatory protein BTN3A (Butyrophilin subfamily 3 member) belonging to the B7 family. BTN3A subfamily includes three members: BTN3A1, A2 and A3. BTN3A2 which is devoid of a functional intracellular domain, is overexpressed in four cancers (pancreatic, gastric, AML and ovary) and might act as a decoy receptor. Our objective was to identify the ligand of BTN3A2, which could be helpful to set up therapeutic strategy. Firstly, binding studies by flow cytometry led to the selection of few T cell lines expressing BTN3A2 ligand. Thus, comparison of the gene expression profile (Agilent microarray) of three positive and two negative cell lines (regarding BTN3A2 binding) allowed to establish a list of membrane proteins expressed only in positive cell lines and which could represent BTN3A2 ligand candidates. The highest fold changes were found for HLA class II molecules. Then Retrogenix cell microarray technology was used to identify potential receptor partners of BTN3A2. Four remaining gene products were selected, PLPP3, SEMA6A, SEMA6C and MSR1. After generation of HEK 293T cell lines overexpressing potential candidates of transcriptomic and Retrogenix, these cells were used for binding assays using BTN3A2-Fc which were negative in all conditions. Finally, chemoproteomic experiments were performed to isolate and identify by mass spectrometry (MS) BTN3A2 ligand. We used an original capture reagent (TFR) with three moieties, allowing covalent binding, which showed clearly BTN3A1 as a potential candidate. We can conclude that BTN3A1/BTN3A2 form a heterodimer. This study confirms heterodimerization of BTN3A1/A2 and shows us the importance of heterodimeric form for recognize its ligand. Furthermore, MSR1 protein (Retrogenix candidate) and ABCA12 (transcriptomic candidate) seem to be part of complex to activate Vγ9Vδ2 T cells.