Soutenance de thèse de Charlotte JALOUX

Les traumatismes des nerfs périphériques (NP) sont fréquents et, malgré des progrès réalisés dans le délai de prise en charge et dans la réparation des NP lésés, les résultats obtenus demeurent très insuffisants. Ces traumatismes peuvent être responsables d’invalidité, de perte de fonction et d’une diminution de la qualité de vie des patients. Plusieurs études ont démontré que la transplantation de cellules souches mésenchymateuses est une bonne stratégie pour améliorer la régénération nerveuse. En revanche, leur recueil nécessite un prélèvement invasif, le plus souvent de moelle osseuse. Les cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses (CSOEM) font partie de la famille des cellules souches mésenchymateuses, présentent une activité mitogène élevée, détiennent un fort potentiel de différenciation vers des lignées neurales et sont stables sur le plan génétique. Ces cellules sont facilement accessibles. Elles sont situées dans la lamina propria de la muqueuse olfactive nasale et sont prélevables de manière très peu invasive (peu douloureux, aucun trouble de l’olfaction). Les CSOEM ont été testées avec succès dans différents modèles animaux de paraplégie, de la maladie de Parkinson, de surdité et d’amnésie. Pour la première fois, nous avons démontré que la greffe de CSOEM accélère et améliore la récupération locomotrice après une perte de substance du nerf péronier chez le rat (article 1). Ce bénéfice thérapeutique est associé à une restauration partielle du phénotype contractile des muscles et à une augmentation de l’axogenèse. Les cellules greffées ne migrent pas dans d’autres organes et demeurent localisées dans le NP. En parallèle, nos recherches nous ont amenés à mettre au point une méthode pour optimiser le procédé de fabrication des cellules souches olfactives humaines et valider leur production dans des conditions de grade clinique, en respectant les critères de bonne fabrique du médicament (article 2). En effet, la greffe de CSOEM pour la réparation du système nerveux périphérique est considérée comme un médicament de thérapie innovante (MTI). Il est donc nécessaire de les fabriquer dans des conditions stériles, avec des produits d’origine synthétique ou humaine. Des modifications majeures ont été apportées au protocole utilisé classiquement pour la culture des cellules dans un laboratoire de recherche fondamentale. Celles-ci concernent la dissociation, le milieu de culture et la prolifération. Cette dernière a augmenté sans entrainer de réarrangements chromosomiques. Un essai clinique de phase I/IIA évaluant la tolérance, la faisabilité et l’efficacité d’une greffe de cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses pour traiter les traumatismes des NP sensitifs (nerfs digitaux et branche sensitive du nerf radial) va prochainement débuter. Au-delà des cellules souches, nous nous sommes intéressés aux vésicules extracellulaires (VEC) qu’elles produisent et qui constituent le substrat paracrine de leur efficacité. Nous les avons extraites des cellules souches par un procédé associant une ultracentrifugation et une chromatographie par exclusion de taille. Ces VEC ont été caractérisées et répondent à de nombreux critères édictés par la société internationale qui regroupent les chercheurs du domaine (CD9+, CD63+, INTEGRIN α5+, GAPDH+, CAVEOLIN+ et ALBUMIN-). Lorsqu’elles sont testées in vitro, ces VEC favorisent la différenciation en neurones et la croissance des prolongements axonaux de la lignée de neuroblastes N2A. L’immunogénicité des VEC est moins importante que celle des cellules. Une utilisation allogénique est donc plus facilement envisageable. Dans le cadre d’une banque préétablie, les VEC seraient disponibles immédiatement et utilisables en complément de la réparation chirurgicale. Des recherches sur les conditions optimales de conservation et les réactions immunologiques des VEC issues de CSOEM doivent être menées avant d’envisager leur utilisation chez l’homme.

Peripheral nerve injuries are common and, despite improvements in the repair delay, the outcomes are still poor. These injuries can result in disabilities, loss of function and reduced quality of life for patients. Several studies showed that mesenchymal stem cell graft is a good strategy to improve nerve regeneration. However, their collection is often invasive, most often from bone marrow. Olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OEMSC) are members of the mesenchymal stem cells family, have high mitotic activity, display a strong potential for differentiation into neural lineages and are genetically stable. These cells are easily accessible. They are located in the lamina propria of the nasal olfactory mucosa and can be harvested in a minimally invasive manner (no pain, no olfaction impairment). OEMSC have been successfully tested in several animal models of Parkinson’s disease, paraplegia, deafness, and amnesia. For the first time, we demonstrated that OEMSC transplantation accelerates and improves locomotor recovery after peroneal nerve loss in rats (article 1). This therapeutic benefit is associated with a partial restoration of the muscular contractile phenotype and an increase in axogenesis. The grafted stem cells do not migrate to other organs and remain localized in the peripheral nerve. In parallel, our research led us to develop a method to optimize the purification process of human OEMSCs and to validate their production under clinical grade conditions, while respecting the criteria of good manufacturing practices (article 2). Indeed, the grafting of OEMSCs for peripheral nerve repair is considered an advanced therapy medicinal product (ATMP). Therefore, it is necessary to manufacture them under sterile condition, with products of synthetic or human origin. Major modifications were made to the protocol traditionally used for cell culture in a basic research laboratory. These concern dissociation, culture medium and proliferation. The latter increased without causing chromosomal rearrangements. A phase I/IIA clinical trial assessing the tolerance, feasibility and efficacy of OEMSC graft in injured sensory peripheral nerves (digital nerves or the sensitive branch of the radial nerve) will begin shortly. In addition to these stem cells, we were interested in the extracellular vesicles (EV) that they produce, and which constitute the paracrine substrate of their effectiveness. We extracted EVs from OEMSCs by a process combining ultracentrifugation and size exclusion chromatography. OEMSC-derived EVs were characterized. They meet numerous criteria set out by the international society of researchers in the field (CD9+, CD63+, INTEGRIN α5+, GAPDH+, CAVEOLIN+ et ALBUMIN-). When tested in vitro, EVs enhance neuronal differentiation and axonal growth of the N2A neuroblast line. The immunogenicity of EVs weaker than that of stem cells. Allogenic use is therefore more feasible. Using a pre-established bank, EVs would be immediately available and could be used as an adjunct to surgical repair. Research into the optimal storage conditions and immunological responses of OEMSC-derived EVs needs to be performed further before their use in humans can be considered.