Soutenance de thèse de Rihane ARIF

L’allergie est l’une des maladies chroniques les plus répandues et représente actuellement un problème majeur de santé public. Une variété de tests, à la fois in vivo et in vitro, sont disponibles en allergologie. Le test de provocation orale constitue l’étalon-or du diagnostic de l’allergie. Cependant, pouvant induire de graves réactions cliniques, il se réalise au sein d’une structure hospitalière. D’autre part, les tests cutanés et sérologiques permettent d’étudier le profil de sensibilisation d’un individu à un/des allergènes (présence d’IgE spécifiques). Ces approches nécessitent une interprétation rigoureuse et permettent d’orienter la démarche de diagnostic de l’allergie. Le test d’activation des basophiles (TAB) est un test cellulaire fonctionnel. En reproduisant ex vivo la réaction allergique, il représente une approche unique en allergologie. Bien que sa pertinence et son utilité ne soient plus à démontrer, du fait de certaines limitations et contraintes techniques, l’utilisation de cette approche reste actuellement limitée à des laboratoires spécialisés. Afin que les capacités du TAB puissent être pleinement exploitées, une levée de ces limitations est indispensable. L’objectif principal de cette thèse a été de travailler à une amélioration technique du TAB en cytométrie en flux. Nous avons simplifié l’ensemble de la chaîne pré-analytique du TAB. L’approche développée utilise une innovation technologique (DURA Innovation, Beckman Coulter) permettant l’emploi de réactifs secs, stables à température ambiante et prêts à l’emploi. La méthode se fait sur du sang total, sans étape de lavage, et ne nécessite que quatre étapes de pipetage avant l’analyse au cytométre. Malgré l’utilisation d’un cocktail d’anticorps de 5 couleurs, aucune compensation n’est requise lors de l’analyse au cytométre. Cette première partie regroupe l’aspect technique de la thèse. La méthode de TAB développée a été mise en œuvre dans différentes études aux cours de cette thèse constituant le volet clinique de la thèse. Dans un deuxième temps, nous avons voulu aller plus loin dans la simplification de la technique du TAB. Nous avons démontré la possibilité de miniaturiser le TAB en le transposant au format plaque 96 puits avec une préparation des échantillons totalement automatisée.

Allergy is one of the most common chronical disease and is currently recognized as a major public health issue. A diversity of tests, both in vivo and in vitro are available in the field of allergology. The oral provocation test is considered as the gold standard of allergy diagnoses. Nevertheless, it can induce severe clinical reaction, need to be performed inside an hospital facility and can also lead to false positive/negative results. On the other hand, skin testing and serum quantification tests allow to study one’s sensibilisation profile to one/several allergens (Specific IgE detected). These methods require meticulous interpretation and allow to guide the allergy diagnosis process. Basophil Activation Test (BAT) is a cellular functionnal test. By reproducing ex vivo allergic reaction, it represents a unique approach in allergology field. Even if the relevance and the utility of the BAT have already been established, the use of this test is currently limited to specialist laboratories. It is indeed necessary to overcome some limitations of the BAT to fully leverage its capabilities. The main objective of this thesis was to work on technical improvements of BAT in flow cytometry. We simplified the whole pre-analytical workflow. The developped BAT procedure uses a technological innovation (DURA Innovation, Beckman Coulter) allowing to use dry reagents, stable at room temperature and ready to use. The process is done on whole blood, using 5 color compensation-free antibody panel, without washing step, and requires only four pipetting steps before cytometre analysis. This first part constitues the technical aspect of the thesis work. This BAT method has been used for different studies during this thesis and constitues the clinical part of the study. In a second step, we wanted to go further into BAT process simplification. We demonstrated the possibility to miniaturize the BAT by transposing it to 96-well plate format with a fully automated sample preparation.