Soutenance de thèse de Lucie PEPINO

La douleur aiguë est souvent considérée comme désagréable, elle a cependant une fonction protectrice importante. Lorsque cette douleur devient chronique, elle perd tout rôle protecteur et reflète un état pathologique du système. De nombreuse études cliniques démontrent que les hommes et les femmes ont un ressenti différent de la douleur, les femmes étant également plus à risque de développer des douleurs chroniques. Au cours des dernière décennies, les recherches menées chez le rongeur ont confirmé certaines de ces observations. Elles ont permis une meilleure compréhension des mécanismes expliquant ces différences liées au sexe, en démontrant une contribution à la fois hormonale et génétique. Une réponse neuroimmunitaire spécifique au sexe a également était mise en avant. Cependant, de nombreux mécanismes restent encore inconnu, notamment dans le cadre des différences liées au sexe dans un contexte de douleur pathologique. Mon projet de thèse vise à étudier les différences liées au sexe dans le contexte de la douleur à la formaline, un modèle de douleur inflammatoire. Pour cela j’ai utilisé une série d’approches expérimentales, allant de la comparaison du comportement global en réponse à une injection de formaline, à l’analyse de l’expression différentielles de gènes dans la corne dorsale de la moelle épinière (CDME) chez des souris mâles et femelles. La formaline induit une douleur spontanée biphasique, séparée par une interphase, une période durant laquelle la douleur ne se manifeste pas. Notre groupe a récemment revisité le paradigme expérimental de la douleur à la formaline, en adaptant le volume injecté au poids des souris. En utilisant cette approche, j’ai montré qu’il n’y avait pas de différence quantitative majeure dans la réponse à la douleur entre les deux sexes. Cependant j’ai observé que, contrairement aux mâles qui présentent un comportement assez homogène, les femelles pouvaient être divisées en deux groupes (F1 et F2), avec une signature comportementale bien distincte. Les F1 avaient une interphase de courte durée, tandis que chez les F2, la durée de l’interphase était prolongée de manière significative. J’ai démontré que les hormones gonadiques et le cycle œstral étaient les principaux facteurs contribuant à ce phénomène. En analysant le niveau d’expression des gènes dans la CDME des groupes ci-dessus, j’ai mis en évidence des différences moléculaires sous-tendant les différences mâle-femelle et F1-F2 dans le modèle de douleur à la formaline. Parmi les gènes différentiellement exprimés, j’ai focalisé mon attention sur les gènes associés à l’inflammation et/ou à la régulation du système immunitaire. En particulier, je me suis concentrée sur le gène codant pour lipocalin-2 (Lcn2). Lcn2 fait partie des molécules induites de manière précoce par une inflammation ou une lésion, et son expression est décrite comme étant enrichie dans les neutrophiles. Des études menés exclusivement chez le rongeur mâle indiquent que Lcn2 régule la douleur inflammatoire et neuropathique. Dans mon analyse transcriptomique, les transcrits codant pour Lcn2 était deux fois plus abondants chez le mâle par rapport aux femelles. Au vu de l’intérêt croissant pour les différences liées au sexe dans la modulation de la douleur par le système immunitaire, j’ai décidé d’explorer davantage cette découverte. En combinant la microscopie confocale avec une analyse en cytométrie de flux, j’ai montré que des cellules exprimant Lcn2 infiltrent la pie mère des méninges spinales en réponse à la formaline et ce chez le mâle mais pas chez la femelle. J’ai également démontré que la grande majorité de ces cellules exprimant Lcn2 font partie des neutrophiles et que la formaline génère un afflux de neutrophiles dans la pie mère spinale, uniquement chez le mâle. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans le cadre de ma thèse, révèlent de nouveaux mécanismes, intervenant dans la régulation spinale de la douleur, et ce de manière spécifique à un sexe.

Acute pain is an unpleasant experience, but with high protective value. In contrast, chronic pain has no protective role and reflects a pathological state. Several clinical studies show that men and women experience pain differently, with women being more susceptible to chronic pain. In rodents, research from the past decades has supported these observations and further shed light onto mechanisms explaining sex-related differences in pain perception. The hormonal and genetic contribution has been demonstrated and sex-specific neuroimmune regulation of pain has been put forward. However, much is still to be unravelled, especially regarding sexual differences in pathological pain. My PhD project aims at addressing sex-linked differences in the formalin pain paradigm, an inflammatory pain model. It was designed to explore potential differences at various levels of analysis, including global behavior, hormone contribution and spinal gene expression in response to formalin evoked pain. Formalin elicits a biphasic spontaneous pain response, separated by a quiescent pain-free period, the interphase. Our group recently redefined the formalin paradigm, by adapting the volume administrated to mice weight. Using this experimental design, I didn’t observe major male-female quantitative differences in the nocifensive response. However, I found that in contrast to males, which exhibit a quite homogenous behavior, females could be split into two groups (F1 and F2), with typical behavioral signatures. F1 females exhibited a short-lasting interphase, while F2 females had a significantly longer one. I found that gonadal hormones and estrous cycle are main contributors to this phenomenon. In addition, using unbiased RNA-Seq analysis of spinal cord dorsal horn (DHSC) tissues from the above-mentioned groups, I highlighted the molecular cues supporting male-females and F1 and F2 differences in formalin pain. Among the set of identified differentially expressed genes (DEG), I was highly interested by those genes associated with inflammation and/or immune regulation. In particular, I found the gene encoding for the early inflammatory neutrophil-associated marker lipocalin2 (Lcn2), to be selectively up-regulated in male DHSC. Male-only mouse studies report that Lcn2 regulates inflammatory and neuropathic pain. Given the growing interest in the sex-related differences in the immune-modulation of pain, I decided to further explore this particular result, in my system. By combining confocal microscopy and flow-cytometry analysis, I showed that Lcn2 positive cells infiltrate the pia layer of spinal meninges following formalin, in males but not females. I further demonstrated that the vast majority of those Lcn2 positive cells belong to the neutrophil immune compartment and that formalin triggers neutrophil influx in the spinal pia in males but not females. Altogether, these data unravel new sex-specific spinal regulatory mechanisms, including immune ones, in formalin evoked pain.