Soutenance de thèse de Asmaa HADJ AHMED

L’électrochimie directe des protéines (PFE) est une technique électrochimique qui consiste à immobiliser une enzyme à la surface d’une électrode dans une configuration où le transfert d’électron est direct. Dans cette technique, l'activité catalytique est mesurée sous forme d’un courant électrique, ce qui permet d’étudier divers aspects de la cinétique de l’enzymes en fonction de différents paramètres expérimentaux en utilisant des méthodes électrochimiques. Étant donné que la réaction catalytique, à la surface de l’électrode, consomme le substrat, une électrode tournante (RDE) est généralement utilisé pour induire un mouvement convectif dans la solution afin de permettre le transport du substrat vers l’électrode pour remplacer le substrat consommé. Toutefois, dans le cas des CO déshydrogénases, qui catalysent l’oxydation réversible du CO en CO2 à des vitesse très élevés (jusqu’à 40000 s-1), la consommation du substrat (CO) à l’électrode est si rapide que la catalyse est principalement limitée par le transport de masse et non par la réaction chimique catalysée, et ce, même à la plus haute vitesse de rotation de RDE. Cette limitation peut masquer des caractéristiques importantes et complique l’analyse de la réponse catalytique. Afin de résoudre ce problème, nous avons conçu une nouvelle cellule électrochimique avec des propriétés de transport améliorées, en cherchant à ce que le transport de masse soit aussi homogène que possible, pour éviter que la concentration du substrat sur l’électrode soit hétérogène. De plus, une attention particulière a été accordée à la force appliquée par le fluide sur la surface (contrainte de cisaillement), qui pourrait détacher l’enzyme de la surface. Dans une étude précédente, l’équipe a utilisé la CFD pour concevoir une nouvelle cellule basée sur la configuration dite "wall-tube" dans laquelle un jet de solution est dirigé vers une électrode statique; cette cellule a été construite et testée expérimentalement. Les simulations et les expériences ont montré qu’elle peut fournir un transport de masse trois fois plus intense que la RDE. Cependant, ce n’était toujours pas suffisant pour notre application pour étudier les enzymes très actives. Au cours de cette thèse, nous avons exploré, à l’aide de CFD, l’effet des différents paramètres de la cellule et proposé des formules semi-empiriques pour prédire le coefficient de transport de masse et la contrainte de cisaillement à l’électrode. Nous avons utilisé une cellule imprimée en 3D pour valider expérimentalement nos prédictions. De plus, nous avons étudié la relation contrainte de cisaillement/perte d’activité catalytique en utilisant la nitrite réductase, une enzyme qui réduit le nitrite en ammoniac. Par ailleurs, la nouvelle cellule s’est avérée utile pour dépasser une autre limitation de la configuration RDE : la difficulté de contrôler les concentrations de substrats et d’inhibiteurs auxquels les enzymes sont exposées. Comme le volume au-dessus de l’électrode est très petit dans la nouvelle cellule (moins de 1μL), cette dernière offre la possibilité de modifier le contenu en changeant simplement la nature du fluide pompé vers l'électrode. En injectant et en mélangeant des solutions de compositions différentes (concentrations, pH, T), il serait possible d’imposer des changements contrôlés des concentrations, du pH et/ou de la température. Cette possibilité a été testée expérimentalement dans la cellule construite en mélangeant deux solutions avec des concentrations différentes de ferricyanure et en enregistrant le courant de réduction de ce dernier en fonction du temps. Les résultats obtenus ont montré que le temps de réponse pour les changements de concentrations et la qualité du mélange ne sont pas suffisants. Par conséquent, pour résoudre ces deux problèmes, nous avons conçu et construit de nouvelles cellules basées sur la géométrie de wall-tube avec des mélangeurs intégrés qui devraient permettre des changements de concentration plus rapides.

Protein Film Electrochemistry (PFE) is an electrochemical technique that consists in adsorbing a film of enzyme at the surface of a suitable electrode in a configuration where the electron transfer is direct. In this technique, the catalytic turnover rate is measured as an electrical current, which allows the investigation of various aspects of enzyme’s kinetics as a function of different experimental parameters using electrochemical methods. Since the catalytic reaction, which takes place at the surface of the electrode, consumes the substrate, a rotating disc electrode (RDE) is usually used to induce a convective motion in the buffer to provide fast transport of the substrate from the bulk towards the electrode so as to compensate substrate consumption. However, in the case of CO dehydrogenases, which are enzymes that catalyze the reversible oxidation of CO to CO2 at very high rates (up to 40000 s-1), the consumption of the substrate (CO) at the electrode is so fast that the catalysis is mostly limited by mass transport and not by the catalyzed chemical reaction, even at high RDE rotation rates. This limitation hides important features and complicates the analysis of the catalytic response. To overcome this limitation, we have chosen to design a new electrochemical cell with improved transport properties, with the condition that mass transport should be as homogeneous as possible, to prevent heterogeneity of substrate concentration on the electrode. Moreover, a particular attention was given to the force applied by the fluid on the surface (shear stress), since it is suspected to wash the enzyme away. In a previous study, the team used computational fluid dynamics (CFD) to design a new cell based on the so-called "wall-tube" configuration in which a jet of electrochemical buffer is pumped towards a static electrode; this cell was built and tested experimentally. Simulations and experiments showed that it can provide 3 times faster mass transport than the RDE. However, that still wasn't enough for our application for studying fast enzymes. Hence, the transport in the cell should be further improved. Thus, in this thesis, we explored, using CFD, the effect of the various parameters of the cell and proposed semi-empirical formulas to predict the mass transport coefficient and shear stress at the electrode. We used a 3D-printed cell to validate experimentally our predictions. Furthermore, we investigated the relationship shear stress/enzyme washing using nitrite reductase which is an enzyme that reduces nitrite to ammonia. Additionally, the new cell was found to be useful to solve a different limitation of the RDE setup which is the difficulty to control the concentrations of substrates and inhibitors that the enzymes are exposed to. Since the volume above the electrode is very small in the new cell (less than 1μL), the wall tube geometry offers the possibility to change the contents by just changing what it is pumped in. By pumping and mixing buffers with different compositions (concentrations, pH, temperature..), imposing arbitrary changes in concentrations, pH, or/and temperature would be realizable. This possibility was tested experimentally in the built cell by mixing two solutions with different concentrations of ferricyanide and recording the reduction current which is proportional to ferricyanide concentration as a function of time. The obtained results showed that the response time for changing concentrations and the mixing quality are not sufficient. Therefore, to address these two issues, we designed and built new cells based on wall tube geometry with integrated mixers that should allow faster concentration changes.