Soutenance de thèse de Alexandre UZEL

De nos jours un des plus grands défis environnementaux est la bioremediation du CO2 atmosphérique. Dans ce contexte, la réduction biocatalytique de ce dernier en formiate par les formiate déshydrogénases microbiennes (FDHs) apparaît très prometteuse. Dans ce travail est présentée une caractérisation RPE de deux FDHs similaires nommées ForCE 1 et ForCE 2 issues de la bactérie du sol Bacillus subtilis. Ces enzymes appartiennent à la superfamille des enzymes à cofacteur de type Mo/W-bisPGD (i.e. pyranopterine guanosine dinucleotide) retrouvées exclusivement chez les procaryotes et catalysant une grande variété de réactions chimiques. Ces deux FDHs sont d’un grand intérêt scientifique. En effet, les analyses de leurs séquences révèlent que leur site actif ne présente pas les résidus consensuels associés à l’activité formiate-déshydrogénase, définissant une sous-famille de FDHs encore non caractérisée. De plus, les voies métaboliques dans lesquelles ces FDHs s’intègrent au sein de cet organisme aérobie facultatif restent à élucider, ouvrant ainsi la voie à d’autres découvertes en biologie. Le coeur catalytique de ForCE 1 et ForCE 2 est composé de deux sous-unités. Les analyses de sequences revèlent que la sous-unité catalytique ForC abriterait cinq centres FeS et un cofacteur de type Mo-bisPGD alors que ForE n’apparait pas héberger de cofacteur. En combinant potentiométrie d’oxydoréduction, spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) multifréquence en onde continue et en mode pulsé, nous avons caractérisé les signatures RPE et les propriétés redox de plusieurs centres paramagnétiques dans l’enzyme ForCE1 purifiée, à savoir quatre centres FeS et deux signatures de type Mo(V) associées au cofacteur à molybdène. Un signal radicalaire intense a également été détecté. L’analyse de ses propriétés rédox et spectroscopiques par RPE multifréquence a permis de l’attribuer à une espèce ménasemiquinone (MSQ) hautement stabilisée dans l’enzyme. De plus, l’utilisation de la spectroscopie hyperfine a permis de caractériser le mode de fixation du radical dans son site protéique. Enfin, l’étude spectroscopique comparative de ForCE1 et ForCE2 confirme les similarités entre les deux enzymes tant du point de vue de la structure des centres métalliques que de celle du radical MSQ stabilisé. Ces résultats indiquent que ForCE1 et ForCE2 sont des ménaquinone:formiate oxydoréductases, ce qui a été confirmé par des études cinétiques utilisant des analogues de quinones, et suggèrent leur connexion avec la phosphorylation oxydative chez Bacillus subtilis.

Nowadays one of the biggest environmental challenges is the bioremediation of atmospheric CO2. The biocatalytic reduction of CO2 to formate by microbial formate dehydrogenases (FDHs) is very promising. In this work, we present the EPR characterization of two similar FDHs, named ForCE 1 and ForCE 2, from the soil bacterium Bacillus subtilis. These enzymes belong to the Mo/W-bisPGD (i.e. pyranopterin guanosine dinucleotide) superfamily, which is widespread in prokaryotes. These two FDHs appear to be of great scientific interest for several reasons : sequence analyses reveal that their active site harbours non-consensual residues for formate-dehydrogenase activity, defining a new FDH sub-familly not yet characterised. Moreover, the way in which these enzymes are integrated into the metabolism of this organism remains to be established, leaving the door open for new biological discoveries. The catalytic core of ForCE1 and ForCE2 is composed of two subunits. From sequence analysis, the larger one (ForC) is thought to coordinate five iron-sulfur clusters and a Mo-bisPGD while ForE does not appear to harbor any cofactor. By combining redox potentiometry, multifrequency continuous wave (CW) and pulsed EPR spectroscopy, we were able to characterize the EPR signatures and redox properties of several paramagnetic cofactors in the purified enzymes including at least four FeS clusters and two MoV species associated to the molybdenum cofactor. An unexpectedly intense radical signal was also detected and could be attributed to a highly stabilized menasemiquinone species based on its redox and spectroscopic properties determined by a multi-frequency EPR approach. Moreover, we provide new insights into the binding mode of the radical using hyperfine spectroscopy. Finally, the comparative spectroscopic study of ForCE 1 and ForCE 2 confirms the similarities between the two enzymes regarding either the structure of the metal centers or that of the stabilized MSK radical. Our results identify the catalytic function of these atypical FDHs as menaquinone:formate oxidoreductases which was confirmed by kinetics studies using quinone analogues and suggest their connection to oxidative phosphorylation in Bacillus subtilis.