Soutenance de thèse de Farah MUSTAPHA

Les lymphocytes T sont activés lorsque les récepteurs membranaires des lymphocytes T (TCR) reconnaissent les peptides antigéniques étrangers présentés par les complexes majeurs d'histocompatibilité (pCMH) des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) au sein d'une interface cellule-cellule spécialisée appelée "synapse immunologique" (SI). De nombreuses recherches décrivent l'aspect biochimique de cette interaction, identifiant les réseaux de ligands sécrétés, les récepteurs de surface cellulaire, les voies de signalisation intracellulaire et les facteurs de transcription en jeu. Néanmoins, cela ne suffit pas à complètement élucider le(s) mécanisme(s) précis de l'activation des lymphocytes T. Ces dernières années, il est apparu que les forces mécaniques générées au niveau de la SI sont essentielles à la bonne activation des lymphocytes T. En effet, on sait maintenant que les cellules T ne sont pas seulement sensibles mais aussi réactives aux forces et ce de l’échelle moléculaire (par le biais du TCR et des molécules d'adhésion, e.g. LFA-1) à l’échelle cellulaire. A cela manque une compréhension détaillée de la transmission de l'information mécanique à travers ces échelles À cette fin, le concept à la base de mon projet était d'étudier si et comment les forces cellulaires, transmises par certaines molécules, influencent l'activation précoce des cellules T. Pour ce faire, nous avons choisi de remplacer la cellule présentatrice d'antigène (CPA) par des gels de polyacrylamide mous. Sachant que les CPA couvrent une plage de rigidité (~0,4-2 KPa) définie en fonction de leur type et de leur statut dans le processus d'inflammation, la première partie de ma thèse a été consacrée à la production de gels ayant l'élasticité la plus faible possible dans cette gamme (400 Pa), et fonctionnalisés avec des anticorps activateurs contre le TCR/CD3, CD28 (molécule co-stimulatrice) et LFA-1 (molécule d'adhésion). L'élasticité des gels a été déterminée par indentation à l’aide de microscopie à force atomique (AFM), tandis que l'homogénéité et la densité des molécules adsorbées ont été quantifiées par microscopie à épifluorescence. Nous avons ensuite étudié l'étalement des cellules et la modulation des propriétés mécaniques des cellules T Jurkat Lifeact-GFP (actine marquée avec GFP) lors de leur interaction avec des gels d'élasticités différentes (0.4-200 KPa), mais fonctionnalisés avec le même anticorps activateur contre le TCR/CD3. Par la suite, nous avons utilisé les gels les plus souples (400 Pa et 2 KPa) pour étudier, à l'aide de microscopie à force de traction (TFM), les contraintes générées et les énergies exercées par les cellules T Jurkat (type sauvage), les cellules T Jurkat Lifeact-GFP et les cellules T Jurkat Lck-GFP (membrane marquée à la GFP). À notre connaissance, de telles mesures à des élasticités aussi faibles et à des stades aussi précoces de l'interaction n'ont jamais été rapportées auparavant. Il est intéressant de noter que nos mesures de TFM dynamiques ont révélé de nouveaux profiles de forces au cours du temps, modulés selon mécanique et la fonctionnalisation du substrat, et également influencés par les modifications génétiques des cellules où des rapporteurs fluorescents sont introduits dans la membrane ou dans le cytosquelette. Enfin, nous avons étendu nos expériences TFM aux cellules T primaires, plus précisément aux cellules T CD4+ humaines mémoire, naïves et stimulées, dans le but d'observer si une différence entre les énergies et entre les contraintes exercées par ces trois sous-types peut être détectée.

T cells are activated when the membrane bound T cell receptors (TCRs) recognize the foreign antigenic peptides presented by the major histocompatibility complexes (pMHCs) of antigen presenting cells (APCs) within a specialized cell-cell interface termed the “Immunological Synapse” (IS). Today, an extensive body of research exists describing the biochemical aspect of this interaction, identifying the networks of secreted ligands, cell surface receptors, intracellular signaling pathways, and transcriptional factors at play. Unfortunately, this has not been sufficient to unravel the precise mechanism(s) of T-cell activation. In recent years, it has become apparent that the mechanical forces generated at the IS are essential for the proper activation of T cells . Indeed, T cells are now known to be not only sensitive but also responsive to forces acting at both the molecular (through the TCR and adhesion molecules e.g. LFA-1) and cellular scale. What is lacking is a detailed comprehension of the transmission of the mechanical information across these scales. To this end, the concept behind my project was to investigate if and how cellular forces, transmitted through certain molecules, influence early T cell activation. To do so, we chose to substitute the antigen presenting cell (APC) with surrogate polyacrylamide gels. Knowing that APCs span a defined stiffness range (~0.4-2 KPa) depending on their type and status in the inflammation process, the first part of my PhD was dedicated to producing gels with the lowest possible elasticity within that range (400 Pa), and functionalized with activating antibodies against the TCR/CD3, CD28 (co-stimulatory molecule) and LFA-1 (adhesion molecule). The elasticity of the gels was determined by indentation using Atomic Force Microscopy, and the homogeneity and density of the coated molecules was verified using epifluorescence microscopy. We then studied the spreading and the modulation of the mechanical properties of Jurkat Lifeact-GFP T cells (actin labeled with GFP) when interacting with gels of different elasticities (0.4-200 KPa), but functionalized with the same activating antibody against the TCR/CD3. After that, we employed the softest gels (400 Pa and 2 KPa) for studying, using traction force microscopy (TFM), the generated stresses and the energies exerted by Jurkat T cells (wild-type), Jurkat Lifeact-GFP T cells and Jurkat Lck-GFP T cells (membrane labeled with GFP). Similar measurements at such low elasticities, and during such early stages of interaction, have never been reported before to our knowledge. Interestingly, our dynamic TFM measurements revealed new patterns of force application over time, that are modulated as a function of substrate mechanics and functionalization, and that are also impacted by the genetic manipulation of cells to introduce fluorescent reporters at the membrane or in the cytoskeleton. Finally, we have also extended our TFM experiments to primary T cells, specifically Memory, Naive and Stimulated human CD4+ T cells, in the aim of observing if any difference in the stresses and energies exerted between these three subtypes can be detected.