Soutenance de thèse de Johanna EXTREMET

LGI1 (Leucine-rich Glioma Inactivated 1) est une glycoprotéine sécrétée dans le système nerveux central. Sa perte de fonction due à une délétion génétique induit l’épilepsie autosomique dominante du lobe temporal latéral et son ciblage par les auto-anticorps chez les patients atteints d'encéphalite limbique (LE) induit des crises focales fréquentes. En conséquence, une activité épileptiforme est observée dans le modèle de souris knock-out LGI1 (KO LGI1) et dans des cultures de tranches neuronales traitées de manière chronique avec des auto-anticorps anti-LGI1. LGI1 est composé d'un domaine Leucine Rich Repeat (LRR) et d'un domaine Epitempin (EPTP). Ces domaines interagissent avec différents partenaires du complexe trans-synaptique formé par LGI1 au niveau des synapses excitatrices. Parmi les membres du complexe, les canaux présynaptiques Kv1.1, une sous-unité des canaux potassiques voltage-dépendants portant le courant ID atténue l'excitabilité intrinsèque (IE) et la libération de glutamate. La perte génétique et le blocage de LGI1 par des IgGs de patients LE entraînent une diminution des canaux Kv1.1 dans l'hippocampe. Au cours de ma thèse, mon objectif était de vérifier si LGI1 pouvait contrôler l’IE par l'expression du courant ID porté par les Kv1. La ré-expression de LGI1 dans les neurones de CA3 de souris KO a été obtenu par électroporation sur cellule unique du gène codant pour LGI1 (neurones KO/LGI1) et l’IE a été vérifiée par des enregistrements en courant-imposé. Une diminution de l’IE a été observée dans ces neurones par rapport aux neurones KO électroporés avec le gène codant pour la GFP (KO/GFP). Cette restauration a été corrélé à la récupération du courant ID mesuré en voltage-imposé et à l’immunomarquage des Kv1.1 au niveau du segment initial de l’axone des neurones KO/LGI1. Comme LGI1 est sécrétée en extracellulaire, son effet paracrine a été testé sur l’IE et l’immunomarquage des Kv1.1. J'ai observé une récupération partielle de l'IE dans les neurones adjacents des neurones KO/LGI1, avec un changement de l'expression des canaux Kv1.1. En conclusion, j'ai montré que la réintroduction du gène LGI1 est suffisante pour retrouver une IE de type sauvage dans les neurones déficients en LGI1 en restaurant l'expression des canaux contenant la sous-unité Kv1.1 et qu'elle affecte l'IE des neurones adjacents par un effet paracrine. Dans la LE, les mécanismes par lesquels la perturbation de LGI1 induit un phénotype pathogène ne sont pas clairs. J'ai essayé de comprendre comment les auto-anticorps LGI1 ciblant un domaine spécifique pouvaient induire des activités épileptiformes dans les neurones de l'hippocampe. Pour répondre à cette question, j'ai mesuré l’IE des neurones pyramidaux de CA3 dans des cultures organotypiques d'hippocampe de rat traités avec un anticorps monoclonal (mAb) réactif au LRR ou à l'EPTP. Une augmentation de l’IE corrélée à une réduction de la sensibilité à un bloqueur sélectif des canaux Kv1.1 a été observée dans les neurones traités avec le mAb anti-LRR par rapport au contrôle, mais pas dans les neurones traités avec le mAb anti-EPTP. Ces résultats suggèrent que les mAb anti-LRR sont capables d'induire une modulation de l'excitabilité neuronale qui pourrait expliquer les activités épileptiformes observées chez les patients. Dans l'ensemble, mon travail a apporté de nouvelles connaissances dans la compréhension des mécanismes par lesquels LGI1 contrôle l'excitabilité neuronale. Notamment, la fonctionnalité des canaux potassiques Kv1.1 médiée par LGI1 est cruciale pour empêcher la dérégulation de l’IE qui entraînerait des activités épileptiformes chez les patients ADLTE et LE.

Leucine-rich Glioma Inactivated 1 (LGI1) is a secreted glycoprotein in the central nervous system. Its genetic loss of function induces Autosomal Dominant Lateral Temporal Lobe Epilepsy and it is targeted by autoantibodies in Limbic Encephalitis (LE) patients who present frequent focal seizures. Accordingly, epileptiform activity is observed in LGI1 knock-out mice model (KO LGI1) and in neuronal slice cultures chronically treated with anti-LGI1 autoantibodies. LGI1 is composed of a Leucine Rich Repeat (LRR) and an Epitempin (EPTP) domain. These domains are reported to interact with different aspects of the transsynaptic complex formed by LGI1 at excitatory synapses, including presynaptic Kv1.1 channels, a voltage-gated potassium channel subunit carrying ID current that dampens intrinsic excitability (IE) and glutamate release. LGI1 deficiency and blocking with patients derived LGI1-IgGs leads to a decrease in Kv1.1 channel in the hippocampus. During my thesis, my aim was to check whether LGI1 could control IE through the expression of Kv1 channel-mediated ID current. Rescue of LGI1 in CA3 neurons of KO mice was obtained by single cell electroporation of Lgi1-encoding gene (KO/LGI1 neurons) and IE was checked by current-clamp recordings. A decrease in IE was observed in these neurons compared to KO neurons electroporated with GFP-encoding gene (KO/GFP). This restored IE was correlated to the rescue of the Kv1.1-mediated ID current measured in voltage clamp and to Kv1.1 immunostaining at the Axon Initial Segment of KO/LGI1 neurons. As LGI1 is released extracellularly, its paracrine effect was tested on IE and Kv1.1 immunostaining. I observed a partial rescue of IE in neurons adjacent to the KO/LGI1 neurons with a change in Kv1.1 channel expression. In conclusion, I showed that reintroducing the LGI1 gene is sufficient to rescue IE in LGI1-deficient neurons by restoring the expression of the Kv1.1-containing channel and that it affects IE of adjacent neurons through a paracrine effect. In LE, the mechanisms by which LGI1 disruption induces a pathogenic phenotype is not clear. I tried to understand how domain-specific LGI1-autoantibodies could induce epileptiform activities in hippocampal neurons. To address this question, I measured the IE of CA3 pyramidal neurons in organotypic cultures from rat hippocampus treated with either a LRR- or an EPTP- reactive patient-derived monoclonal Antibody (mAb). An increase of IE correlated with a reduction of the sensitivity to a selective Kv1.1-channel blocker was observed in neurons treated with the LRR mAb compared to the control, but not in neurons treated with the EPTP mAb. These findings suggest that LRR mAbs are able to induce modulation of neuronal excitability that could explain epileptiform activities observed in patients. Overall, my work brought new insight in the understanding of mechanisms by which LGI1 control neuronal excitability. Notably, LGI1-mediated Kv1.1 potassium channels functionality is crucial to prevent deregulation of IE that would result in epileptiform activities in ADLTE and LE patients.