Soutenance de thèse de Phong Quoc NGUYEN

Les rétroéléments se répliquent par transcription inverse de leur génome ARN en un ADNc qui est intégré de manière stable dans le génome de la cellule hôte par leur propre intégrase (IN). L'intégration ne se produit pas au hasard in vivo, révélant un modèle de sites préférés spécifiques aux rétroéléments, qui dépend principalement de l'interaction des IN avec des facteurs cellulaires qui attachent les intégrases à des sites spécifiques. Cependant, les mécanismes par lesquels ces facteurs interagissent avec l'IN et contribuent au processus d'intégration sont encore mal compris. Des connaissances importantes sur la biologie rétrovirale ont été acquises en étudiant les rétrotransposons Ty LTR de la levure Saccharomyces cerevisiae. En particulier Ty1, le rétrotransposon de levure le plus étudié, cible son intégration aux gènes transcrits par l'ARN polymérase III (Pol III), situés dans les régions pauvres en gènes du génome. Cette remarquable sélectivité des sites d'intégration a été étudiée in vivo et in vitro. Cependant, il n'y a pas d'informations structurelles sur le processus d'intégration de Ty1 ou l'interaction avec Pol III. Pour fournir des informations structurelles sur le processus d'intégration, nous avons exprimé et purifié les versions recombinantes de Ty1 IN à partir d'Escherichia coli et de baculovirus, avec une bonne quantité et qualité pour les analyses biochimiques et biophysiques. Nos protéines recombinantes ont des caractéristiques biochimiques similaires à celles du Ty1 IN recombinant dans les rapports précédents exprimés dans S. cerevisiae. Nous montrons par des techniques biophysiques que la protéine recombinante IN est monomérique et a une forme allongée, avec trois domaines repliés à la moitié N-terminale responsable de l'intégration et une moitié C-terminale qui est désordonnée. Nous avons également assemblé l'IN avec l'ADNc pour la caractérisation des intasomes Ty1 au niveau atomique. Bien que nous n'ayons pas encore pu obtenir de structures à haute résolution des intasomes Ty1, nous avons pu former deux types de complexes d'intasomes, des assemblages filamenteux longs et des assemblages globulaires. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour terminer la caractérisation de ces intasomes à haute résolution. Enfin, nous avons caractérisé l'interaction Ty1 IN et Pol III à haute résolution par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Nous avons obtenu deux structures à 2,6 et 3,1 pour le complexe réticulé Ty1 IN–Pol III et le complexe d'élongation Ty1 IN–Pol III à l'état de pause, respectivement. Nos structures et études de mutagenèse fonctionnelle indiquent comment un court peptide à l'extrémité de la moitié C-terminale de Ty1 IN, comprenant les résidus 609-625, se lie à la sous-unité AC40 de Pol III. Fait intéressant, nous observons le domaine de type TFIIS C-terminal de la sous-unité C11 à l'intérieur du pore de l'entonnoir Pol III dans nos structures. Ces résultats suggèrent que Ty1 IN induit une conformation de Pol III qui a C11 C-terminal à l'intérieur du pore de l'entonnoir, augmentant ainsi le temps de résidence de Pol III sur le génome et, par conséquent, augmentant les chances d'intégration de Ty1 IN sur le génome de la levure. Dans l'ensemble, nos données structurelles et biochimiques apportent un nouvel éclairage sur notre compréhension du mécanisme d'intégration de Ty1 chez S. cerevisiae au niveau des gènes transcrits Pol III.

Retroelements replicate by reverse transcription of their RNA genome into a cDNA that is stably integrated into the host-cell genome by their own integrase (IN). Integration does not occur randomly in vivo, revealing a retroelement-specific pattern of preferred sites, which depends mostly on INs interaction with cellular factors that tether integrases to specific sites. However, the mechanisms by which these factors interact with IN and contribute to the integration process are still poorly understood. Important understandings on retroviral biology have been gained by studying Ty LTR-retrotransposons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. In particular Ty1, the most studied yeast retrotransposon, targets its integration to RNA polymerase III (Pol III)-transcribed genes, located in gene-poor regions of the genome. This remarkable integration site selectivity has been studied in vivo and in vitro. However, there is no structural information on the Ty1 integration process or the interaction with Pol III. To provide structural information on the integration process, we expressed and purified the recombinant versions of Ty1 IN from Escherichia coli and baculovirus, with good quantity and quality for biochemical and biophysical analyses. Our recombinant proteins have similar biochemical characteristic with recombinant Ty1 IN in previous reports expressed in S. cerevisiae. We show by biophysical techniques that the IN recombinant protein is monomeric and has an elongated shape, with three folded domains at the N-terminal half responsible of integration and a C-terminal half that is disordered. We also have assembled the IN with the cDNA for the characterization of Ty1 intasomes at atomic level. Although we could not obtain high resolution structures of Ty1 intasomes yet, we were able to form two types of intasome complexes, long filamentous assemblies and globular assemblies. Further research is needed to complete characterizing these intasomes at high resolution. Finally, we characterized Ty1 IN and Pol III interaction at high resolution by cryo-electron microscopy (cryo-EM). We obtained two structures at 2.6 Å and 3.1 Å for the crosslinked Ty1 IN–Pol III complex and Ty1 IN–Pol III elongation complex in a paused state, respectively. Our structures and functional mutagenesis studies indicate how a short peptide at the end of the Ty1 IN C-terminal half, comprising residues 609-625 binds to the AC40 subunit of Pol III. Interestingly, we observe the C-terminal TFIIS-like domain of the C11 subunit inside the Pol III funnel pore in our structures. These results suggest that Ty1 IN induces a conformation of Pol III that has C11 C-terminal inside the funnel pore, thus increasing the residence time of Pol III on the genome and, in consequence, enhancing the integration chance of Ty1 IN on yeast genome. Altogether, our structural and biochemical data shed new light on our understanding of the mechanism of Ty1 integration in S. cerevisiae at Pol III transcribed genes.