Ecole Doctorale
SCIENCES CHIMIQUES - Marseille
Spécialité
Sciences Chimiques
Etablissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Biocatalyse,Baeyer-Villiger monooxygenases,cyanobacteries,procédé en cellules entières,Soutenabilité,Chimie Verte
Keywords
Biocatalysis,Baeyer-Villiger monooxygenases,Cyanobacteria,whole-cell biotransformations,sustainability,Green Chemistry
Titre de thèse
Oxyfonctionnalisation par des cyanobactéries recombinantes produisant des Baeyer-Villiger Monooxygenases NADPH dépendantes
NADPH Dependent Oxyfunctionalization by Baeyer-Villiger Monooxygenases in Cyanobacteria
Date
Mardi 15 février 2022 à 14:00
Adresse
52 Av. Escadrille Normandie Niemen, 13013 Marseille Amphithéâtre INSPE
Jury
Examinateur |
M. Thierry GIARDINA |
Aix-Marseille Université-Institut des Sciences Moléculaires de Marseille (iSm2 UMR CNRS 7313) |
Rapporteur |
M. Florian RUDROFF |
Vienna University of Technology |
Examinateur |
M. Harald PICHLER |
Technical University of Graz |
Rapporteur |
Mme Carine VAXELAIRE-VERGNE |
CEA/DRF/ Institut de Biologie François Jacob/Genoscope/UMR8030 |
Directeur de these |
Mme Veronique ALPHAND |
Aix-Marseille Université-Institut des Sciences Moléculaires de Marseille (iSm2 UMR CNRS 7313) |
CoDirecteur de these |
M. Robert KOURIST |
Technical University of Graz |
Résumé de la thèse
Le poly-ɛ-caprolactone (PCL) est un polymère dintérêt, biodégradable mais dorigine fossile. Sa synthèse chimique actuelle nécessite de l'acide peracétique pour l'oxydation de la cyclohexanone, un réactif dangereux à grande échelle. Si les Baeyer-Villiger monooxygénases (BVMO) catalysent cette oxydation dans des conditions douces, elles nécessitent l'apport stchiométrique de composés organiques auxiliaires pour le recyclage des cofacteurs. De plus, dans les procédés en cellules entières, l'approvisionnement en oxygène, souvent limitant du fait dune vitesse de transfert faible et de la respiration des cellules, plafonne la densité cellulaire utilisable et donc la productivité volumétrique. Récemment, lutilisation de cyanobactéries recombinantes produisant une BVMO a permis de remplacer les composés organiques auxiliaires par de l'eau comme donneur d'électrons et d'exploiter la production photosynthétique de dioxygène. Cependant, la productivité en est très faible en raison de la formation de sous-produits indésirables.
Nous décrivons ici un procédé alternatif reposant sur le clonage d'une nouvelle BVMO dans Synechocystis PPC6803 et prenant avantage d'une souche modifiée de cette cyanobactérie dans laquelle la chaîne de transport d'électrons photosynthétiques (PETC) a été modifiée.
Ainsi, à partir d'un précédent clonage à haut débit, nous avons identifié et caractérisé une BVMO, issue de la bactérie Burkholderia xenovorans, dont les caractéristiques cinétiques rendent possible la diminution des réactions secondaires endogènes dans Synechocystis. Plusieurs souches de cyanobacteries recombinantes ont été construites en combinant souches, plasmides et promoteurs, afin de sélectionner la plus efficace. De meilleures conditions de culture et de biotransformation ont également été recherchées (lumière, température, densité cellulaire, ...).
Pour encore améliorer le système, nous avons utilisé comme hôte le mutant Synechocystis ∆flv1, un mutant knock out pour la protein flv1/3, et donc capable de fournir une plus grande disponibilité d'O2 et de NADPH à l'enzyme.
Nos résultats ont montré que les goulots d'étranglement mentionnés précédemment dans l'utilisation des cyanobactéries, tels que l'auto-ombrage (self-shading) des cellules et la formation de produits secondaires, peuvent être surmontés. Des activités spécifiques élevées ont été atteintes à haute densité cellulaire (3.7 mM h-1), en autre en manipulant la chaîne de transport d'électrons photosynthétiques (PETC).
Nous avons ainsi démontré le potentiel des cyanobactéries oxygéniques comme châssis pour l'oxydation enzymatique de cétones, améliorant l'économie datomes de la biocatalyse redox et fournissant du dioxygène pour les réactions d'oxyfonctionnalisation. Le procédé décrit ici est un procédé soutenable, utilisant la lumière comme source dénergie, leau et le gaz carbonique comme sources dhydrogène, doxygène et de carbone, et qui répond aux exigences de la Chimie Verte.
Thesis resume
Poly-ɛ-caprolactone (PCL) is a useful and widespread bio-degradable, petrol-based polymer. Its current chemical synthesis requires hazardous peracetic acid for the oxidation of cyclohexanone, a process unfavourable in terms of safety and sustainability. While Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) catalyse this oxidation under very mild reaction conditions, they require the stoichiometric supply of auxiliary organic compounds for cofactor recycling. Moreover, in whole cells processes, the oxygen supply, often limiting due to low transfer rate and cell respiration, caps the usable cell density and thus the volumetric productivity. Recently, the use of recombinant cyanobacteria producing BVMO have made it possible to replace auxiliary organic compounds with water as an electron donor and to exploit photosynthetic oxygen production. However, productivity was very low due to undesirable by-products.
Here we described an alternative process relying on the cloning of a new BVMO in Synechocystis PPC6803 and taking advantage of an engineered strain of this cyanobacterium in which the photosynthetic electron transport chain (PETC) had been redesigned.
Thus, from a previous High Throughput Cloning, we identified and characterized a new BVMO, from the bacteria Burkholderia xenovorans, whose kinetic features make possible the decrease of endogenous side reactions in Synechocystis. Several recombinant cyanobacterial strains were constructed by combining strains, plasmids and promoters, in order to select the most efficient one. Better culture and biotransformation conditions (light, temperature, cell density,
) were also searched.
To further improve the system, we used as host the cyanobacterial mutant Synechocystis ∆flv1, a flavodiiron protein flv1/3 knock-out mutant, thus able to provide a higher availability of O2 and NADPH to the enzyme.
Our results showed that the previously mentioned bottlenecks in the use of cyanobacteria such as self-shading of the cells and the formation of side products, can be overcome. High specific activities can be achieved at high cell densities, also by manipulating the photosynthetic electron transport chain (PETC).
Thus, we demonstrated the potential of oxygenic cyanobacteria as chassis for enzymatic oxidation of ketones, improving atom economy of redox biocatalysis and providing dioxygen for oxyfunctionalization reactions. The process described here is a sustainable process, using light as an energy source, water and carbon dioxide as sources of hydrogen, oxygen and carbon, and meets the requirements of Green Chemistry.