Soutenance de thèse de Brice CHANEZ

Décrypter les mécanismes qui régulent la cascade métastatique aboutissant à la formation de métastases, principale cause d'échec thérapeutique chez les patients atteints de cancer, est primordial et conditionne le développement de nouvelles approches thérapeutiques. La migration et l'invasion des cellules tumorales sont requises pour l'étape de dissémination vasculaire. Les microtubules (MT), un constituant important du cytosquelette contribue à la division cellulaire ce qui en fait une cible thérapeutique de choix en onco-hématologie. Dans les cellules en interphase, l'extrémité " + " des MT explore le cytoplasme et s'ancre aux structures cellulaires périphériques. Durant ma thèse, j'ai essayé de comprendre comment les protéines régulant l'extrémité " + " des MT (+TIP), leur dynamique et l'ancrage à la membrane, contribuent à la migration cellulaire et la dégradation de la matrice extracellulaire. Nous avons d'abord évalué l'impact d'un nouvel agent thérapeutique dépolymérisant les MT, l'éribuline, sur la migration de cellules de cancer du sein. A doses infracytotoxiques, l'éribuline induisait une diminution de la vitesse de croissance et un défaut de capture des MT au cortex cellulaire, entrainant la perturbation de la migration en réponse à un stimulus chimiotactique. Des concentrations croissantes d'éribuline entrainaient la dissociation progressive des +TIP EB1, CLIP170 et ch-TOG de l'extrémité + des MT et que la dissociation de la tubuline polymérase ch-TOG précédait la perte des autres +TIP. Nous avons finalement démontré que déplétion de ch-TOG affectait la croissance, la capture des MT et la migration cellulaire, de la même manière que l'éribuline. Nous proposons donc que les effets de l'éribuline sur la dynamique des MT et la migration cellulaire, sont médiés par son action sur l'extrémité " + " des MT et le déplacement de ch-TOG. Dans un deuxième temps, nous avons examiné le rôle des +TIP dans la dégradation par les cellules tumorales de la matrice extracellulaire, une étape précoce de l'invasion médiée par le biais de protrusions riches en actine et spécialisées dans la dégradation matricielle, les invadopodes. Nous avons identifié par déplétion systématique des +TIP avec des siARN spécifiques, qu'EB1 et deux de ses partenaires, APC et ACF7, régulaient négativement l'assemblage et l'action des invadopodes, dans les lignées tumorales mammaires MDA-MB-231 et MCF10A+TGFβ. L'inactivation d'autres partenaires d'EB1 comme CLASP1 et 2, et CLIP170 ne modifiaient pas les capacités de dégradation des cellules. Ces résultats montrent que les différents partenaires d'EB1 ont des effets différents dans la formation des invadopodes. Ils laissent aussi entrevoir l'existence d'un complexe fonctionnel incluant EB1, APC et ACF7, dont le rôle est démontré dans la capture des MT et la migration dirigée, et qui participerait à la régulation négative des invadopodes. Il sera important d'en définir le mode d'action. En parallèle, nous avons mis en place une approche protéomique systématique pour identifier de nouveaux acteurs de la formation des invadopodes. Nous avons exprimé la protéine TKS5, spécifique et indispensable à l'action des invadopodes, fusionnée à la biotine ligase BirA dans les cellules de cancer du sein ; puis identifié par biotinylation de proximité in situ, les voisins proches de TKS5, au sein de l'invadopode. Nous avons validé cette approche et identifié de nouveaux partenaires, dont une protéine associée aux MT. L'optimisation de cette approche pourra permettre de valider la présence ou non de protéines candidates, notamment les +TIP, au sein de l'invadopode, et apporter des précisions sur leur mode d'action. Au total, les +TIP, par la régulation de la dynamique des MT, interviennent dans différentes étapes de la cascade métastatique et développer des stratégies ciblées contre ces acteurs pourrait être pertinent dans la prise en charge du cancer du sein.

Identifying new mechanisms involved in metastatic spread, which is the leading cause of patient treatment failure in oncology, is one of the major challenge for modern cancer science, and a prerequisite for the development of new treatments. Cell migration and invasion are required for reaching and spread through vessels. Microtubules (MT), a major element of the cytoskeleton, are well known for their contribution to cell division and constitute one of the main targets for chemotherapy in onco-hematology. In interphase cells, MT grow radially from the centrosome, their dynamic + ends exploring the cytoplasm until reaching and anchoring at peripheral cellular structures. During my thesis, I have aimed to understand whether MT-associated proteins of the +TIP (+ end tracking protein) family,which are major regulators of MT dynamics and anchoring, contribute to two essential steps of metastasis: cell migration and degradation of the extracellular matrix. We have first investigated the impact of eribulin, a new MT targeting agent, upon the migration of breast cancer cells. We have observed that infra-cytotoxic doses of eribulin, which do not unpolymerize MTs, led to reduced MT growth rate and defective MT capture at the cell leading edge, leading to disturbed chemotaxis. Increasing doses of eribulin led to progressive loss of the EB1 and CLIP170 +TIP proteins from MT +ends. We have however observed that, at the lowest concentrations used, the loss of the ch-TOG tubulin polymerase from +ends preceded the loss of other +TIP. We have finally shown that ch-TOG silencing mimicked the effects of eribulin low dose eribulin treatment on MT growth rate, MT capture and directed cell motility. Thus, we propose that effects of eribulin on MT dynamics and cell migration are mediated by its impact on MT + end and ch-TOG displacement. We have then addressed the role of +TIP in breast tumor cell extracellular matrix degradation, an early step of invasion mediated by invadopodia, actin-rich cell protrusions specialized in matrix degradation. We have evaluated the contribution of EB1 and EB1-associated proteins to invadopodia assembly/disassembly cycle, using specific siRNAs. We found that the knockdown of EB1 and of two of its partners, the APC tumor suppressor and the ACF7 spectraplakin, was associated with increased matrix degradation and a higher number of precursor and mature invadopodia, in both MDA-MB-231 breast tumor cells and TGFβ-treated MCF10A mammary cells. On the contrary, EB1 binding proteins CLASP1 and 2 and CLIP170 had no impact on matrix degradation. These results show that EB1-associated proteins have distinct roles in invadopodia regulation. They also suggest that EB1-APC-ACF7 complex, whose function was already shown in MT capture and directed cell migration, could be involved in regulating invadopodia function. The exact mechanism by which this complex represses invadopodia remains to be addressed. In parallel, we implemented an original proteomic approach in order to systematically identify proteins that contribute to invadopodia. We constructed and expressed a protein fusing TKS5, a protein localized to invadopodia and required for their assembly, and the biotin ligase BirA in invasive breast carcinoma cells. We then identified, through in situ proximity biotinylation, close partners of TKS5 within invadopodia. We have identified known TKS5-associated protein, validating the approach, and novel TKS5 partners, including a MT-associated protein, which represent novel potential mediators of invadopodia function. When optimized, the technique might also serve to validate candidate proteins including +TIP in invadopodia, and thus contribute to deciphering their mode of action. To conclude, +TIP, through their impact on MT dynamics, contribute to several steps of the metastatic cascade, and might thus represent relevant therapeutic targets within metastatic breast cancer curative strategy.