Soutenance de thèse de Corentin FRANCO

Les microvésicules (MV) sont des éléments submicroniques (100nm-1µm) produits par la plupart des cellules vivantes via un processus de bourgeonnement de la membrane cellulaire. La production des MV dépend de plusieurs propriétés cellulaires en lien avec leur état d’activation, leur état de stress, ou de leur viabilité. Les MV portent certains antigènes membranaires des cellules dont elles sont issues et exposent des éléments favorisant la coagulation comme les phospholipides anioniques ou le facteur tissulaire. Les microvésicules portant le facteur tissulaire (MV-FT) sont aujourd’hui reconnues comme un biomarqueur potentiel majeur du risque de thrombose veineuse dans des contextes où la plupart des tests d’hémostase restent insuffisants pour discriminer les patients à risque. Nous avons travaillé durant cette thèse à concevoir un bio-essai permettant une mesure sensible, spécifique, reproductible et potentiellement automatisable de l’activité pro-coagulante liée au facteur tissulaire en utilisant l’immuno-séparation magnétique (IMS) pour isoler les MV. Nos diverses phases d’optimisation ont été guidées par l’analyse des MV par cytométrie en flux d’une part et par la mesure effective de l’activité des MV-FT capturées. Sur différents liquides biologiques (plasma, salive et liquide pleural), nous avons pu vérifier l’efficacité de ce système d’immuno-capture en comparaison de la méthode d’isolement de référence; la centrifugation rapide. De plus, en utilisant des anticorps spécifiques de lignées cellulaires, nous avons pu extraire sélectivement de divers échantillons biologiques des sous-populations de MV pour déterminer l’origine cellulaire de l’activité MV-FT. En support à ce travail, nous avons mis au point des outils de standardisation pour l’analyse des MV par cytométrie en flux incluant la quantification des antigènes membranaires par immuno-fluorescence.

Microvesicles (MV) are submicronic elements (100nm-1µm) produced by most living cells by a mechanism of budding from cell membrane. The release of MV depends on many cell properties, including cell activation and stress status, and cell viability. MV carry some membrane antigens of the cells from they are derived and expose clotting-promoting elements such as anionic phospholipids or tissue factor. Microvesicles harbouring tissue factor (MV-FT) are now considered as a major potential biomarker of the risk of venous thrombosis in contexts where most hemostasis tests remain insufficient to discriminate patients at risk. During this thesis, we have worked on the development of a bioassay providing a sensitive, specific, reproducible and potentially automatable measurement of tissue factor-related procoagulant activity using magnetic immunoseparation (IMS) to isolate MV. Our various optimization phases were driven by the analysis of MV by flow cytometry on the one hand, and by the actual measurement of the activity of the captured MV-FT on the other. On different biological fluids (plasma, saliva and pleural fluid), we were able to confirm the efficiency of this immuno-capture system compared to the reference isolation method; rapid centrifugation. In addition, using lineage-specific antibodies, we were able to selectively extract from various biological samples, MV sub-populations to determine the cellular origin of MV-FT activity. In support of this work, we have developed standardization tools for the analysis of MV by flow cytometry including the quantification of membrane antigens by immuno-fluorescence.