Soutenance de thèse de Kilian RUMINSKI

L’efficacité des réponses immunitaires dépend de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Parmi les acteurs de ces processus, les lymphocytes T jouent un rôle central dans l’induction et le maintien de l'immunité adaptative. Les lymphocytes vont permettre d’amplifier la réponse immunitaire et de conférer une réponse spécifique à l’antigène. La reconnaissance de l’antigène va initier une réorganisation moléculaire permettant ainsi la transmission du signal depuis la surface de la cellule jusqu’au centre du noyau conduisant aux fonctions effectrice du lymphocyte. L’objet de ce travail de thèse a consisté en l’élaboration de nouvelles méthodes biochimiques pour disséquer de manière fine les réarrangements moléculaires des voies de signalisation du TCR et de celle de CD28. Dans ce cadre, nous avons tout d’abord combiné une stratégie innovante de purification par affinité de protéines couplée à l’identification par spectrométrie de masse (AP-MS) avec le système CRISPR/Cas9 permettant d’effectuer des modifications génétiques précises. En utilisant cette méthode, nous avons pu déterminer l’intéractome de SLP-76 dans un contexte de perturbation moléculaire où les adaptateurs de la famille GRB2 ont été inactivés. Les résultats de ces expériences ont démontré une déstabilisation complète du signalosome de SLP-76 en l’absence de GADS et partielle dans le cas de GRB2. De manière plutôt surprenante, l’analyse d’autres éléments de la signalisation du TCR montre qu’ils sont peu affectés par l’inactivation des adaptateurs de la famille GRB2 indiquant de possible compensations ou redondances associées à leurs fonctions. Néanmoins, les défauts de signalisation observés sont suffisants pour réduire les fonctions des cellules T effectrices à un degré quantitatif dépendant de l'adaptateur ciblé. Dans la seconde partie de cette thèse nous avons étudier la voie de signalisation associée au récepteur de co-stimulation CD28 et mis au point une technique permettant de déterminer des intéractome par AP-MS dans les cellules suite à une stimulation TCR engageant les ligands naturels exprimés sur les cellules présentatrices d’antigènes (CPA). En conclusion, ces analyses serviront de base pour déterminer l’intéractome et la signalisation de récepteurs de co-stimulation ou de co-inhibition présent à l’interface de la synapse immunologique dans un contexte proche des conditions physiologiques.

The effectiveness of immune responses depends on complex and highly coordinated cellular processes. Among the actors of these processes, T lymphocytes play a central role in the induction and maintenance of adaptive immunity. Lymphocytes will amplify the immune response and confer a specific response to the antigen. The recognition of the antigen will initiate a molecular reorganization allowing the transmission of the signal from the cell surface to the center of the nucleus leading to the lymphocyte's effector functions. The object of this thesis work consisted in the development of new biochemical methods to finely dissect the molecular rearrangements of TCR and CD28 signalling pathways. In this framework, we first combined an innovative strategy of protein affinity purification coupled with identification by mass spectrometry (AP-MS) with the CRISPR/Cas9 system allowing to perform precise genetic modifications. Using this method, we were able to determine the SLP-76 interactome in a context of molecular perturbation where the adaptors of the GRB2 family were inactivated. The results of these experiments demonstrated a complete destabilization of the SLP-76 signalosome in the absence of GADS and partial destabilization in the case of GRB2. Surprisingly, the analysis of other elements of the TCR signaling shows that they are little affected by the inactivation of the GRB2 family adapters indicating possible compensations or redundancies associated with their functions. Nevertheless, the observed signaling defects are sufficient to reduce the functions of effector T cells to a quantitative degree depending on the targeted adapter. In the second part of this thesis we studied the signaling pathway associated with the CD28 co-stimulation receptor and developed a technique to determine AP-MS interactome in cells following TCR stimulation involving natural ligands expressed on antigen presenting cells (APCs). In conclusion, these assays will serve as a basis for determining the interactome and the signalling of co-stimulation or co-inhibition receptors present at the interface of the immunological synapse in a context close to physiological conditions.