Soutenance de thèse de Maria ALBERDI

Salmonella est un pathogène bactérien intracellulaire résidant dans une vacuole appelée SCV. Deux systèmes de sécrétion de type III permettent l’établissement de cette niche bactérienne en injectant des facteurs de virulence (effecteurs) dans le cytosol des cellules infectées. Ces effecteurs sont capables de perturber un grand nombre de fonctions des cellules hôtes et en particulier de provoquer, lors de la phase de réplication, la formation de tubules membranaires dynamiques qui émanent des SCVs et s’étirent au long du cytosquelette microtubulaire. Ces tubules sont appelés Salmonella-induced tubules (SIT). Ils permettent à la bactérie de capter dans la cellule les nutriments nécessaires à sa réplication. La souche de Salmonella n’exprimant pas l’effecteur SifA est incapable d’induire la formation de SITs et présente une virulence atténuée dans un modèle murin d’infection. Ce phénotype souligne l’importance des SITs lors de l’infection bactérienne. PipB2 est un autre effecteur impliqué dans la formation de SITs. Il recrute sur les SCVs la Kinésine-1, un moteur moléculaire qui se déplace le long des microtubules et qui dans les cellules infectées permet l’extension de tubules. Dans ce travail, nous avons montré l’importance de la Kinésine-1 pour la formation de SITs en utilisant des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris mutantes n’exprimant pas la Kinésine-1. Nous avons également observé dans ces cellules une distribution péri-nucléaire des SCVs beaucoup plus marquée que dans les macrophages issus de souris sauvages. Cependant, aux temps tardifs de l’infection, nous avons observé la présence de SCVs en périphérie cellulaire, suggérant l’intervention d’un moteur moléculaire autre que la Kinésine-1. Des travaux antérieurs de l’équipe ont démontré l’interaction directe entre PipB2 et la Kinésine-1, mais on ignore si cette interaction concerne la forme active ou inactive du moteur moléculaire ou si elle a des conséquences sur son activité. Pour explorer ces questions, nous avons développé un test in vitro de mobilité des microtubules (gliding). Nous avons observé que la Kinésine-1 recrutée par PipB2 dans ces conditions expérimentales est capable de déplacer des microtubules et donc active. Nous avons également confirmé que PipB2 interagit exclusivement avec la Kinésine-1. Nous avons développé in vitro un système biomimétique des SITs. Cela consiste à explorer la possibilité de forcer la formation de tubules à partir de vésicules uni-lamellaires géantes (GUVs), de moteur moléculaire et de microtubules. L'équipe de Patricia Bassereau (Paris) a montré que le domaine moteur de la Kinésine-1 le permettait. Dans une configuration similaire utilisant PipB2 pour fixer la Kinésine-1 (holoenzyme), nous avons également observé la formation de tubules membranaires ressemblant aux SITs. Ce système minimal in vitro pourrait représenter un outil puissant pour l’étude d’autres effecteurs ou protéines hôtes impliqués dans la tubulation dans les cellules infectées. Une hypothèse postule que PipB2 lie la Kinésine-1 inactive et que le complexe formé de l’effecteur SifA et de SKIP, sa cible chez l’hôte, est responsable de son activation. Cependant nos résultats mettent en évidence que la Kinésine-1 liée à PipB2 est active. Pour mieux comprendre cette interaction nous avons utilisé un test de centrifugation des microtubules. Nous avons constaté que la fraction de Kinésine-1 liée aux microtubules augmente en présence de PipB2. Ce résultat suggère que PipB2, en liant la Kinésine-1, est capable de l’activer. Une augmentation significative de la Kinésine-1 liée aux microtubules en présence de PipB2 a permis de valider ce résultat. En résumé, ce travail approfondit notre compréhension de l’interaction entre l'effecteur de Salmonella PipB2 et de la protéine moteur Kinésine-1. Une meilleure compréhension des processus moléculaires engagés au cours de l'infection pourrait mener à l'amélioration des stratégies de lutte contre l'agent pathogène.

Salmonella is an intracellular bacterial pathogen residing in a vacuole called SCV. Two type III secretion systems (T3SS-1 and T3SS-2) allow the establishment of this bacterial niche by injecting virulence factors (effectors) into the cytosol of infected cells. These effectors are able to disrupt a large number of host cell functions and in particular to cause, during the replication phase, the formation of membrane tubules emanating from the SCV and stretching along the microtubule cytoskeleton. These tubules are called Salmonella-induced tubules (SIT). They allow the bacteria to capture the nutrients needed for replication in the cell. The strain of Salmonella that does not express the SifA effector is unable to induce the formation of SITs and exhibits attenuated virulence in a mouse model of infection. This phenotype underlines the importance of SITs in bacterial infection. PipB2 is another effector involved in the formation of SITs. It recruits on the SCVs Kinesin-1, a molecular motor which moves along the microtubules and which in infected cells allows the extension of SITs. In this work, we have shown the importance of Kinesin-1 for the formation of SITs by using macrophages derived from the bone marrow of Kif5b-/- mice, the gene encoding the heavy chain of Kinesin-1 in these cells. We also observed in these cells a more compact distribution of SCVs around the nucleus as compared to macrophages from wild type mouse. However, in the late stages of infection, we observed the presence of SCVs at the cellular periphery, suggesting the intervention of a molecular motor other than Kinesin-1. Previous work by the team has demonstrated the direct interaction between PipB2 and Kinesin-1, but it is not known whether this interaction involves the active or inactive form of the molecular motor or whether it affects its activity. We have developed an in vitro gliding test to explore these questions. We observed that under the experimental conditions Kinesin-1 recruited by PipB2 is capable of moving microtubules and therefore active. We also confirmed that PipB2 interacts exclusively with Kinesin-1. We have developed in vitro a biomimetic system of SITs. This involves exploring the possibility of forcing the formation of tubules from giant unilamellar vesicles (GUVs), molecular motors and microtubules. Patricia Bassereau's team (Paris) has shown that the Kinesin-1 motor domain is sufficient to pull membrane tubules from GUVs. In a similar configuration using PipB2 to bind Kinesin-1 (holoenzyme), we also observed the formation of SIT-like membrane tubules. This minimal in vitro system could represent a powerful tool for the study of other effectors or host proteins involved in tubulation in infected cells. One hypothesis postulates that PipB2 binds inactive Kinesin-1 and that the complex formed by the SifA effector and SKIP, its target in the host, is responsible for its activation. However, our results show that PipB2-linked Kinesin-1 is active. To analyze this discrepancy we used a microtubule spin-down test. We found that the Kinesin-1 fraction linked to microtubules increases in the presence of PipB2. This result suggests that PipB2 by binding Kinesin-1 is able to activate it. Kinesin-1 is a tetrameric protein formed by two light chains (KLC) and two heavy chains (KHC). Using Cos-7 cells over-expressing these subunits, PipB2 and other effectors, we tested this new hypothesis in vivo. The results show that the fraction of Kinesin-1 bound to microtubules increases significantly in the presence of PipB2. In summary, this work deepens our understanding of the interaction between the Salmonella PipB2 effector and the Kinesin-1 motor protein. A better knowledge of the molecular processes involved during infection could lead to improved pathogen control strategies.