Soutenance de thèse de Grigorios KYRIATZIS

L'épilepsie est l'un des troubles neurologiques le plus courant, le plus grave et le plus répandu, touchant environ 60 millions de personnes dans le monde (6 millions en Europe). Un tiers des patients atteints d'épilepsie ne répondent pas aux thérapies pharmacologiques actuellement disponibles, soulignant des besoins médicaux non satisfaits. La neurotensine (NT) est un neuropeptide de 13 acides aminés, très conservé entre les espèces, qui agit comme neurotransmetteur et neuromodulateur. La NT a été impliquée dans la physiopathologie de nombreux troubles du SN et psychiatriques, y compris l'épilepsie. Cependant, les mécanismes en jeu et les récepteurs à la NT (NTSR) impliqués restent largement inconnus. La NT induit ses effets centraux et périphériques via trois sous-types de récepteurs (NTSR1, NTSR2 et NTSR3) identifiés et clonés à ce jour. NTSR1 et NTSR2 sont couplés à des protéines G avec sept domaines transmembranaires et exprimés dans différents types cellulaires du SN et à différents stades de développement. Dans le cerveau de rat, NTSR1 est exprimé préférentiellement au stade prénatal, dans les neurones. En revanche, NTSR2 est exprimé dans le cerveau murin du 10-14ème jour postnatal, et son expression augmente avec l'âge. Au delà des neurones, NTSR2 est exprimé également dans les astrocytes. A ce stade, on sait peu de choses sur le rôle potentiel de la NT dans la modulation de la neuroprotection et de la neuroinflammation et les récepteurs impliqués. Durant ma thèse, j'ai étudié l'expression de NTSR2 dans l'hippocampe, et sa modulation, in vivo, après une épilepsie expérimentale du lobe temporal induite par une injection de pilocarpine chez des rats adultes où une neuroinflammation intense est observée, et in vitro, après induction d'une inflammation dans des cellules primaires astrogliales. Les approches de l’immunohistochimie, l'immunocytochimie et de la RT-qPCR ont été principalement utilisées. En parallèle, nous avons utilisé un analogue vectorisé de la NT pour étudier les effets de l’'inflammation induite par les facteurs pro-inflammatoires IL1b et LPS. Finalement, nous avons utilisé des cultures de neurones de l’hippocampe pour étudier un rôle potentiel de NTSR2 dans la mort neuronale. Nos résultats montrent pour la première fois une expression de la protéine NTSR2 dans les astrocytes de l'hippocampe de rat adulte, à la fois in vivo et in vitro. Chez les rats épileptiques, la protéine NTSR2 est augmentée de manière aiguë et significative dans l'hippocampe après l'induction du status epilepticus (SE) et parallèlement à la neuroinflammation observée dans ce modèle, dans le gyrus denté et la corne d'Ammon. L'expression de NTSR2 diminue ensuite dans la phase chronique. Après l'état de mal, l'immunoréactivité de NTSR2 est également augmentée dans les astrocytes périvasculaires et leurs pieds terminaux, et est observée dans les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique. Nous montrons que NTSR2 est induit dans les astrocytes et les cellules microgliales in vitro après induction d'une inflammation avec des facteurs pro-inflammatoires, et que le traitement des cultures astrogliales avec l'analogue de la NT diminue son expression ainsi que la réactivité astrocytaire et microgliale. Enfin, nous montrons que NTSR2 est un médiateur de la mort cellulaire, sachant que la surexpression de NTSR2 in vitro induit la mort des neurones de l'hippocampe alors que le traitement avec un analogue de la NT protège contre la mort neuronale. L’ensemble de mes résultats montre un nouveau rôle pour la NT via le récepteur NTSR2 dans les processus neuroinflammatoires et de mort neuronale et suggère que le récepteur NTSR2 pourrait devenir une cible thérapeutique intéressante pour moduler ces processus neurophysiopathologiques.

Epilepsy is one of the commonest, most serious and most ubiquitous neurological disorders affecting approximately 60 million people in the world (6 million in Europe). One-third of patients with epilepsy fail to respond to currently available pharmacological therapies, underlining unmet medical needs. Neurotensin (NT) is a 13 amino acids neuropeptide, highly conserved between species, which acts as a neurotransmitter and neuromodulator in the central nervous system. NT has been also implicated in the pathophysiology of many neural and psychiatric disorders, including epilepsy. However, the mechanisms at stake and the NT receptors (NTSRs) involved remain largely unknown. NT mediates its central and peripheral effects by interacting with three receptor subtypes that have been identified and cloned to date, namely NTSR1, NTSR2 and NTSR3. NTSR1 and NTSR2 are G protein-coupled receptors with seven transmembrane domains that are expressed in different cell types of the nervous system and at different developmental stages. In the rat brain, NTSR1 appears to be localized exclusively in neurons, and is preferentially expressed prenatally. On the other hand, NTSR2 appears in the murine brain from the 10th-14th postnatal day, and its expression increases with age. Besides neurons, NTSR2 expression has been detected also in astrocytes. To date, not much is known on the potential role of NT in modulating neuroprotection and neuroinflammation and which receptors are involved. In this thesis, I studied the expression of NTSR2 in the hippocampus, and its modulation under pathological conditions, in vivo, after experimentally induced temporal lobe epilepsy in adult rats, using the pilocarpine model, during which animals undergo a rapid and intense neuroinflammatory reaction in the hippocampus, and in vitro, after induction of inflammation in cultured glial cells. The main approaches include immunohistochemistry, immunocytochemistry and RT-qPCR. In parallel, we used a vectorized NT analogue to study its effects on experimentally induced inflammation using proinflammatory factors IL1β and LPS. Last, we used hippocampal neuronal cell cultures to study the potential role of NTSR2 in neuronal death. Our results show for the first time unambiguous expression of NTSR2 protein in hippocampal astrocytes of the adult rat, both in vivo and in vitro. In the epileptic rats, NTSR2 protein is increased acutely and significantly in the hippocampus after induction of status epilepticus (SE) and in parallel to neuroinflammation that occurs in this model, in the dentate gyrus & Ammon’s horn. Subsequently, NTSR2 expression decreases at the chronic phase. Following SE, NTSR2 immunoreactivity was also increased in perivascular astrocytes and their end-feet, and was apparent in endothelial cells of the blood-brain barrier. We show that NTSR2 is induced in astrocytes and microglia in vitro after induction of inflammation with proinflammatory factors, and that treatment of the cultured glial cells with the NT analogue decreased NTSR2 expression as well as astrocytic and microglial reactivity. Finally, we found that overexpression of NTSR2 in vitro in hippocampal neurons induced cell death while cells treated with the NT analogue were protected against neuronal death. Taken together, the results presented in this thesis propose a novel role for NT mediated by NTSR2 in neuroinflammation and neuronal death and suggest that targeting the NTSR2 receptor could modulate such neurophysiopathological processes.