Soutenance de thèse de Jessica COLOMBO

La polymérisation de l'actine fournit la force nécessaire à de nombreux processus vitaux de la cellule eucaryote, tels que la migration ou l'endocytose. La réaction de polymérisation est alimentée par des monomères chargés d'ATP, qui sont progressivement hydrolysés dans les filaments d'actine, et les segments des filaments d'actine riches en ADP sont progressivement désassemblés. La dynamique rapide du cytosquelette d'actine nécessite également un recyclage des monomères d'actine de l'état ADP à l'état ATP. Bien que le cycle de l'actine ait été identifié depuis plusieurs décennies, notre compréhension de la façon dont les protéines de liaison de l'actine collaborent avec l'actine pour réguler chaque étape de ce cycle reste insatisfaisante. Principalement, nos connaissances sur le recyclage de l'actine sont pauvres, et ne nous permettent pas de comprendre comment ce processus se produit au rythme mesuré dans les cellules. Ce travail de thèse est basé sur le constat que notre compréhension du recyclage de l'actine est limité pour deux raisons. Tout d'abord, nous manquons de sondes de haute qualité pour suivre l’état du nucléotide lié à l'actine. Deuxièmement, nous manquons de systèmes biomimétiques appropriés pour étudier facilement le renouvellement de l'actine. Pour contourner ces limitations, j'ai procédé dans deux directions différentes mais complémentaires. Premièrement, comme les sondes actuelles permettant de suivre le nucléotide lié à l'actine ne sont pas sensibles et ne peuvent pas être utilisées en imagerie, j'ai cherché à identifier une famille de nucléotides fluorescents se liant à l'actine. J'ai démontré que, parmi les diverses molécules disponibles dans le commerce, les dérivés de N6-(6-Amino)hexyl-ATP se lient à l'actine avec des caractéristiques similaires à celles de l'ATP. Ces nouvelles sondes permettent de suivre l'assemblage de l'actine et l'échange de nucléotides par microscopie, à l’échelle de la molécule unique, et par anisotropie de fluorescence résolue dans le temps, fournissant ainsi des outils robustes et très polyvalents pour étudier la dynamique de l'actine. En outre, ces nucléotides fluorescents maintiennent des interactions fonctionnelles avec les protéines de liaison à l’actine, sont hydrolysés dans les filaments d'actine et fournissent de l'énergie pour alimenter les processus utilisant l'actine. Ces outils devraient permettre à notre domaine de déterminer les conditions dans lesquelles l'actine est recyclée aux rythmes cellulaires. Deuxièmement, une autre limitation à la compréhension du renouvellement de l'actine est le manque de systèmes appropriés pour la reconstitution du cycle de l'actine in vitro. La plupart des systèmes actuels ne reproduisent pas les conditions cellulaires, où les réactions biochimiques se produisent en petits volumes et où un recyclage rapide est essentiel. En m'inspirant de systèmes déjà décrits dans la littérature, j'ai commencé à concevoir un système biomimétique pour reconstituer un cortex d'actine dynamique dans un environnement confiné. Ce système utilise des émulsions d’eau dans l'huile et des protéines purifiées. J'ai pu reconstituer la formation de cortex d'actine à la surface interne des gouttelettes. Ces structures sont encore statiques, mais ce système devrait être implémenté dans le futur avec des protéines de liaison à l'actine impliquées dans le recyclage. Ma thèse ouvre de nouvelles perspectives pour ce domaine. Les deux systèmes que j'ai développés devraient être utilisés à l'avenir en synergie afin de déterminer les conditions biophysiques et biochimiques nécessaires pour maintenir un cytosquelette d’actine dynamique.

Actin polymerization provides force for vital processes of the eukaryotic cell, such as migration or endocytosis. The polymerization reaction is fueled by ATP-charged monomers, which are gradually hydrolyzed within actin filaments, and ADP-rich segments of actin filaments are progressively disassembled. Rapid dynamics of the actin cytoskeleton also requires a recycling of actin monomers from the ADP-state to the ATP-state. Although the actin cycle was identified decades ago, our comprehension of how actin-binding proteins collaborate with actin to regulate every steps of this cycle remains unsatisfactory. Principally, our knowledge on actin recycling is poor, and does not allow us to understand how such process occurs at cellular rates. This thesis work is based on the observation that our understanding of actin recycling has remained limited due to two limitations. First, we lack high-quality probes to track the state of the nucleotide bound to actin. Second, appropriate biomimetic systems to study actin turnover easily are lacking. To circumvent those limitations, I proceeded in two different but complementary directions. First, because current probes tracking the nucleotide bound to actin are not sensitive and cannot be imaged, I aimed at identifying a family of highly sensitive fluorescent nucleotide analogues that bind to actin. I demonstrated that among various chemistries available commercially, N6-(6-Amino)hexyl-ATP derivatives bind to actin with similar characteristics than ATP. These new probes enable monitoring actin assembly and nucleotide exchange with single-molecule microscopy and time-resolved fluorescence anisotropy, therefore providing robust and highly versatile tools to study actin dynamics. In addition to that, these fluorescent nucleotides maintain functional interactions with ABPs, are hydrolyzed within actin filaments, and provide energy to power actin-based processes. These tools should enable our field to determine conditions in which actin is recycled at cellular rates. Second, another limitation to the comprehension of the actin turnover is the lack of suitable systems for the reconstitution of actin turnover in vitro. Most current systems do not reproduce cellular conditions, where biochemical reactions occur in small volumes and where fast recycling is essential. Taking inspiration from systems already described in the literature, I have started engineering a biomimetic system to reconstitute a dynamic actin cortex in a confined environment. This system uses water-in-oil emulsions and purified proteins. I was able to reconstitute the formation of actin cortexes at the inner surface of the droplets. These structure are still static, but this system remains to be implemented with additional actin-binding proteins involved in actin recycling. My thesis opens new perspectives for the field. The two systems that I developed should be used synergistically in the future in order to determine the biophysical and biochemical conditions that are required to maintain actin turnover.