Soutenance de thèse de Mustapha FELLAG

La tuberculose est une infection contagieuse mortelle causée par les mycobactéries formant le complexe Mycobacterium tuberculosis (MTC). Notre revue de la littérature fait une synthèse des sources et des modes de transmission des MTC, montrant l’absence de barrière d’espèce entre les MTC et de multiples espèces mammifères; et la survie des MTC dans l’environnement inanimé où elles peuvent survivre dans les amibes libres. Ce point a retenu notre attention pour réfléchir à l’utilisation de la coculture cellulaire pour l’isolement et la culture des mycobactéries MTC. Nous avons suivi en culture cellulaire 66 échantillons prélevés chez 43 patients, pour l’isolement et la culture d’une souche de M. tuberculosis et une souche de Mycobacterium bovis BCG résistant à la culture axénique. Nous avons observé une activité antituberculeuse des prélèvements, éventuellement rapportée aux traitements antituberculeux. Ensuite, nous avons observé 80% de réduction de la concentration de rifampicine après incubation avec des fibroblastes embryonnaires du poumon humain (cellules HEL), suggérant un effet tampon de la culture cellulaire sur la rifampicine ; ou bien un métabolisme inactivateur par les cellules HEL. En mycobactériologie clinique, ces travaux ont permis d’affiner le diagnostic chez deux patients infectés par des MTC, et de préciser les échantillons cliniques nécessitant une mise en culture sur cellules pour l’isolement des MTC en quantité compatible avec le séquençage génomique. Également, nos recherches bibliographiques nous ont appris la possibilité de contamination par MTC par voie digestive que nous avons questionnée en développant un modèle murin d’infection par M. tuberculosis par voie digestive. Nous avons observé la translocation de M. tuberculosis à partir du tube digestif aux tissus lymphatique et pulmonaire chez la majorité des souris infectées, en présence de souris contrôles négatifs. Cependant, une minorité de souris n’ont présenté aucune tuberculose maladie, de façon surprenante sur un fond génétique identique et des conditions expérimentales identiques. Nous avons observé une diminution de la diversité bactérienne du microbiote digestif chez les souris infectées par rapport aux souris témoins ; et avons émis l’hypothèse que ces différences dans le microbiote digestif pourraient expliquer les différences d’expression de la tuberculose dans ce modèle. Nous avons translaté ces données expérimentales par l’observation par culturomics du microbiote digestif de patients atteints de tuberculose pulmonaire versus des patients contrôles. Nous avons observé une diminution de la diversité bactérienne du microbiote digestif chez les patients tuberculeux. Surtout, nous avons isolé sept espèces bactériennes retrouvées uniquement chez les contrôles nontuberculeux. La mise au point de PCR spécifiques a donné une prévalence plus grande pour Enterococcus mundtii et Enterococcus casseliflavus dans les selles des patients non-tuberculeux (non significatif). Enfin, la coculture de E. mundtii et E. casseliflavus avec 4 espèces MTC a montré d’une façon inattendue une inhibition de la croissance des MTC par E. mundtii et E. casseliflavus. Ces résultats indiquent que E. mundtii et E. casseliflavus sont donc des bactéries antituberculeuses par un mécanisme qui reste à explorer.En conclusion, ces travaux de Thèse nous ont permis d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions entre cellules humaines et les MTC clarifiant mieux l’utilité des cultures cellulaires pour l’isolement des MTC à partir des prélèvements cliniques ; éventuellement environnementaux. D’autre part ces travaux démontrent la diminution de la diversité bactérienne du microbiote digestif suite à l’infection par M. tuberculosis, certaines bactéries du microbiote digestif pouvant interagir directement avec M. tuberculosis en inhibant sa croissance ; ouvrant des perspectives de recherche en médecine humaine et vétérinaire.

Tuberculosis is a fatal contagious infection caused by the mycobacteria that form the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Our literature review provides a synthesis of the sources and modes of transmission of MTBC, showing the absence of a species barrier between MTBC and multiple mammalian species; and the survival of MTBC in the inanimate environment where they can survive in free amoebae. This point has attracted our attention in considering the use of cell co-culture for the isolation and culture of MTBC mycobacteria. We followed up 66 cell culture samples from 43 patients for isolation and culture of one strain of M. tuberculosis and one strain of Mycobacterium bovis BCG resistant to axenic culture. Antituberculosis activity was observed in the specimens, possibly related to tuberculosis treatment. Then, we observed an 80% reduction in rifampicin concentration after incubation with human lung embryonic fibroblasts (HEL cells), suggesting a buffering effect of the cell culture on rifampicin; or an inactivated metabolism by HEL cells. In clinical mycobacteriology, this work made it possible to refine the diagnosis in two patients infected with MTBC, and to specify the clinical samples requiring cell culture for isolation of MTBC in quantities compatible with genome sequencing. Also, our literature searches revealed the possibility of MTBC contamination via the digestive tract, which we questioned by developing a mouse model of M.tuberculosis infection via the digestive tract. We observed the translocation of M. tuberculosis from the gastrointestinal tract to lymphatic and lung tissue in most infected mice in the presence of negative control mice. However, a minority of mice showed no tuberculosis disease, surprisingly on an identical genetic background and identical experimental conditions. We observed a decrease in the bacterial diversity of the igestive microbiota in the infected mice compared to the control mice; and hypothesized that these differences in the digestive microbiota could explain the differences in TB expression in this model. We translated these experimental data by observing the digestive microbiota of patients with pulmonary tuberculosis versus control patients by culturomics. We observed a decrease in the bacterial diversity of the digestive microbiota in patients with tuberculosis. Most importantly, we isolated seven bacterial species found only in non-tuberculous controls. The development of specific PCR gave a higher prevalence of Enterococcus mundtii and Enterococcus casseliflavus in the feces of non-tuberculous patients (not significant). Finally, coculture of E. mundtii and E. casseliflavus with 4 MTBC species unexpectedly showed inhibition of MTBC growth by E. mundtii and E. casseliflavus. These results indicate that E. mundtii and E. casseliflavus are therefore antituberculous bacteria by a mechanism that remains to be explored.In conclusion, this PhD work allowed us to bring new knowledge on the interactions between human cells and MTBC clarifying better the usefulness of cell cultures for the isolation of MTBC from clinical; possibly environmental samples. On the other hand, this work demonstrates the decrease in the bacterial diversity of the digestive microbiota following infection by M. tuberculosis, as certain bacteria of the digestive microbiota can interact directly with M. tuberculosis by inhibiting its growth; opening up research prospects in human and veterinary medicine.