Soutenance de thèse de KAYYIL VEEDU Malavika
Titre de thèse
Exploration et amélioration de la sensibilité de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) des nanoparticules aux protéines sans marquage pour les applications de biodétection et de nanopores
Exploring and improving fluorescence correlation spectroscopy (FCS) sensitivity from nanoprobe to label-free proteins for biosensing and nanopore applications
Résumé de la thèse
La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique puissante et polyvalente qui analyse les fluctuations d'intensité de fluorescence au sein d'un petit volume afin de révéler des processus moléculaires dynamiques tels que la diffusion, les réactions chimiques et les changements conformationnels. Elle est devenue un outil précieux en physique, chimie et biologie. Cependant, certains facteurs limitent la FCS, comme le bruit de fond, le chevauchement spectral, le photoblanchiment et le marquage hétérogène. Cette thèse explore des stratégies pour réduire ces limitations et améliorer la sensibilité et la limite de détection de la FCS. Elle débute par une introduction à la technique et offre un aperçu général de ses applications, avantages et limitations. Nous explorons ensuite la capacité de la FCS à étudier la photophysique de nanoparticules telles que des nano-agrégats d'or et des nanoparticules de lanthanides à l'échelle de la particule unique. Ceci peut s'avérer complexe en raison de leur longue durée de vie, entraînant une faible luminosité et une saturation précoce. Enfin, nous explorons la spectroscopie de corrélation de durée de vie de fluorescence (FLCS), une variante de la FCS qui utilise l'information sur la durée de vie de fluorescence pour distinguer la contribution des émetteurs et du bruit de fond. La technique FLCS permet de surmonter le chevauchement spectral et de réduire considérablement le bruit de fond, améliorant ainsi le rapport signal/bruit (RSB). Nous avons étudié la capacité de multiplexage de la FLCS dans un mélange ternaire de trois composants présentant des spectres d'émission se chevauchant. Nous avons ensuite exploré la limite de détection de la FLCS dans la gamme des faibles concentrations et déterminé les paramètres responsables de cette limite. Nous avons également introduit un facteur de correction FLCS afin d'améliorer encore la limite de détection. Nous avons utilisé ces connaissances pour estimer la constante de vitesse d'association de l'interaction streptavidine-biotine. Le marquage des protéines est connu pour induire des dommages structuraux et fonctionnels. Par conséquent, dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à l'UV profond et nous nous sommes concentrés sur la détection de protéines sans marquage, en utilisant l'autofluorescence intrinsèque des résidus d'acides aminés aromatiques. Nous avons discuté des limitations de la microscopie UV et de l'importance de la stabilisation du tampon et des antioxydants pour les atténuer. Nous avons également montré comment l'optimisation des conditions de solvant et de la configuration du microscope confocal peut améliorer la limite de détection de la streptavidine sans marquage. Nous avons également constaté que l'agitation de l'échantillon permet de réduire considérablement le photoblanchiment et d'améliorer la luminosité de la streptavidine. Cette luminosité accrue a été utilisée pour comprendre la coopérativité streptavidine-biotine. Étant donné que toutes les techniques présentées manquent de spécificité pour identifier la protéine, nous avons également proposé une perspective future d'utilisation de nanopores plasmoniques basée sur une stratégie de lecture optique. Notre approche visant à limiter le bruit de fond et à améliorer la photostabilité des protéines pourrait s'avérer utile pour les applications des nanopores. En conclusion, cette thèse présente différentes stratégies pour surmonter les limitations de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et améliorer la sensibilité de la technique pour les applications de biodétection. Cette approche peut être utile pour l'étude d'émetteurs faiblement fluorescents et de concentrations extrêmement faibles avec un faible rapport signal/bruit.
Thesis resume
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful and versatile technique that analyzes fluorescence intensity fluctuations within a small volume to reveal dynamic molecular processes such as diffusion, chemical reactions, and conformational changes, and has become an invaluable tool across physics, chemistry, and biology. But some factors act as limitations to FCS, like background noise, spectral overlap, photobleaching, heterogeneous labelling, etc. This thesis explores strategies to reduce these limitations and enhance the sensitivity and detection limit of FCS. The thesis starts with an introduction to the technique and gives a broad overview of its applications, advantages, and limitations. Further, we explore the capability of FCS to study the photophysics of nanoprobes like gold nanoclusters and lanthanide nanoparticles at a single particle level. This could be challenging due to their long lifetime, leading to low brightness and early saturation. Later, we explore Fluorescence lifetime correlation spectroscopy (FLCS), a variant of FCS that uses fluorescence lifetime information to distinguish the contribution of emitters and background. FLCS can be used to overcome spectral overlap and it also substantially reduces background, improving the signal-to-background ratio (SBR). We investigated the multiplexing capability of FLCS in a ternary mixture of three components with overlapping emission spectra. Then we explored the detection limit of FLCS in the low concentration range and determined the parameters responsible for this limit. We also introduced an FLCS correction factor to further improve the detection limit. We used our understanding to estimate the association rate constant of the streptavidin-biotin binding interaction. Labelling of proteins is known to create structural and functional damage to the protein. Hence, in the last part, we moved to deep UV, and we focused on label-free protein detection utilising the intrinsic autofluorescence of aromatic amino acid residues. We discussed the limitations of UV microscopy and the significance of buffer stabilisation and antioxidants to reduce those limitations. We also showed how optimising the solvent condition and microscope configuration of the confocal setup can improve the detection limit of label-free streptavidin. We also figured out that stirring the sample can substantially reduce photobleaching and improve the brightness of the streptavidin protein. This improved brightness was used to understand streptavidin-biotin cooperativity. Since all the techniques discussed lack specificity to identify the protein, we also put forwarded a future perspective on using plasmonic nanopores based on an optical readout strategy. Our approach to limit background and improving protein photostability can be helpful for nanopore applications. Conclusively, this thesis presents different strategies to overcome the FCS limitations and improve the sensitivity of the technique for biosensing applications. This approach can be helpful when dealing with weak emitters and ultra-low concentrations with low SBR.