Soutenance de thèse de PUROHIT Devam
Titre de thèse
Modulation et quantification de la mécanique musculaire chez la drosophile
Modulation and quantification of Drosophila muscle mechanics
Résumé de la thèse
Les muscles sont des effecteurs essentiels du comportement animal, car ils traduisent les signaux neuronaux en mouvements. En général, la plupart des muscles sont composés d'unités structurelles et fonctionnelles appelées sarcomères. Les sarcomères sont des structures pseudo-cristallines définies comme la région située entre deux disques Z, où des filaments d'actine parallèles sont réticulés. Ces filaments d'actine pointent vers les filaments de myosine situés au centre et se chevauchent avec ceux-ci. La région entourant les disques Z, dépourvue de myosine, est appelée bande I, tandis que la région contenant de la myosine est appelée bande A. Lors de la contraction du sarcomère, la bande I se contracte, tandis que la bande A reste constante. L'élasticité du sarcomère est attribuée à une longue protéine qui s'étend sur la moitié du sarcomère, appelée titine. La région de la bande I de la titine contient des domaines Ig élastiques et des régions PEVK, qui contribuent largement à l'élasticité et supportent la tension passive du sarcomère.
L'homologue de la titine de la bande I chez la drosophile est Sallimus (Sls), qui s'étend du disque Z au début du filament de myosine. L'insertion d'une région PEVK supplémentaire dans Sallimus (Sls) augmente la longueur de la bande I et de la protéine Sls. De façon surprenante, cela entraîne également une augmentation de la longueur des filaments d'actine et de myosine, ce qui se traduit par un rapport constant entre la bande I et la bande A. Cela suggère l'existence d'une boucle de rétroaction biomécanique entre les filaments d'actine et de myosine et la titine élastique, permettant la mise à l'échelle des dimensions du sarcomère. Cependant, le mécanisme exact de cette rétroaction sur la mécanique des sarcomères reste à explorer.
Au cours de ma thèse de doctorat, nous avons cherché à étudier comment la région PEVK de Sls assure la rétroaction biomécanique entre les composants du sarcomère de la drosophile et à vérifier si la modification de la longueur de la région PEVK modifie les propriétés mécaniques du sarcomère. Dans le cadre de l'objectif 1, nous avons cartographié les propriétés viscoélastiques des différentes régions sarcomériques à haute résolution dans des sarcomères de mouche de type sauvage provenant de muscles de vol adultes et de muscles de la paroi corporelle larvaire, à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM), et nous les avons comparées à celles de sarcomères contenant une version extra-longue de PEVK Sls. Nos résultats montrent que dans les sarcomères des muscles de vol, l'insertion de PEVK dans Sls rend la bande I, et de manière intéressante également la bande A, plus souples. Nous observons également une augmentation spécifique de la fluidité dans la bande I. Cela suggère que la dissipation d'énergie est plus élevée, ce qui indique une inefficacité des muscles. Les propriétés viscoélastiques des sarcomères des muscles larvaires montrent qu'ils sont d'un ordre de grandeur plus souples et plus fluides que les sarcomères des muscles de vol et, là encore, l'insertion de PEVK supplémentaire dans Sls diminue encore leur rigidité.
Dans le cadre de l'objectif complémentaire 2, nous avons mis au point un appareil d'étirement des larves de drosophile, qui permet d'étirer des larves vivantes de type sauvage ou mutantes sous un microscope confocal, tout en surveillant la longueur des sarcomères. Cela a permis d'augmenter la longueur des sarcomères de manière contrôlée et d'obtenir des images de la dynamique des protéines des sarcomères. Nous quantifions actuellement la relation force-longueur chez ces larves en étirant mécaniquement les muscles et en induisant leur contraction à l'aide de l'optogénétique.
Thesis resume
Muscles are crucial effectors of animal behaviour, as they translate neuronal signals into movement. Generally, most of the muscles are composed of structural and functional units called sarcomeres. Sarcomeres are pseudo-crystalline structures that are defined as the region between two Z-discs, at which parallel actin filaments are crosslinked. These actin filaments point to and overlap with the centrally located myosin filaments. The region surrounding the Z-discs, that is devoid of myosin is called the I-band, while the myosin containing region is called the A-band. During sarcomere contraction the I-band shrinks, while the A-band stays constant. The elasticity of the sarcomere is attributed to a long protein that spans the half-sarcomere, called titin. The I-band region of titin contains elastic Ig domains and PEVK regions, that largely contribute to the elasticity and bear the passive tension of the sarcomere.
The Drosophila I-band titin homolog is Sallimus (Sls), which spans from the Z-disc to the beginning of the myosin filament. Inserting an extra PEVK region into Sallimus (Sls) increases the length of the I-band and the Sls protein itself, as expected. Interestingly, it also results in an increase in actin and myosin filament lengths, resulting in a constant I-band to A-band ratio. This suggested a biomechanical feedback loop between actin and myosin filaments with the elastic titin, allowing for the scaling of sarcomere dimensions. However, the exact mechanism of this feedback on sarcomere mechanics remains to be explored.
During my PhD thesis, we aimed to investigate how the Sls PEVK region mediates biomechanical feedback between the components of the Drosophila sarcomere and test if changing the PEVK length changes the mechanical properties of the sarcomere. In aim 1, we mapped the viscoelastic properties of the different sarcomeric regions at high resolution in wild-type sarcomeres from adult flight and larval body wall muscles, using atomic force microscopy (AFM), and compared them with sarcomeres containing an extra-long PEVK Sls version. Our results show that in flight muscle sarcomeres, insertion of PEVK into Sls makes the I-band, and interestingly also the A-band, softer. We also see a specific increase in fluidity in the I-band. This suggests that the energy dissipation is higher, indicating inefficient muscles. The viscoelastic properties of the larval muscle sarcomeres show that they are an order of magnitude softer and more fluid-like than the flight muscle sarcomeres and, again insertion of extra PEVK into Sls further decreases their stiffness.
In the complementary aim 2, we have established a Drosophila larval stretching apparatus, which can stretch living wild-type or mutant larvae under the confocal microscope, while the sarcomere length can be monitored. This allowed to increase sarcomere length in a controlled way and image the dynamics of the sarcomere proteins. We are currently quantifying the force-length relationship in these larvae by mechanically stretching the muscles and inducing their contraction using optogenetics.