Soutenance de thèse de AURELIE DAUMAS

Introduction : Le sepsis constitue une des principales causes de mortalité tant en médecine ambulatoire qu’en milieu hospitalier notamment dans la population gériatrique. Un diagnostic précoce ainsi que l’identification de la gravité du tableau sont les 2 principaux éléments nécessaires pour une prise en charge rapide, optimale, synonyme d’amélioration du pronostic. La réalité clinique est qu’il est souvent difficile d’affirmer le caractère infectieux de la réaction inflammatoire systémique observée et que malgré l’amélioration des techniques microbiologiques, jusqu’à 40% des infections ne sont pas documentées. Patients et méthodes : Nous avons utilisé la spectrométrie de masse MALDI-TOF, outil de routine pour l’identification des micro-organismes pour identifier un profil de réponse spécifique des PBMCs à une agression infectieuse. Cette approche pourrait ainsi apporter une aide au clinicien pour orienter la prise en charge du patient avant même l’identification microbiologique. Nous nous sommes également intéressés à la formation in vitro de granulomes, structures organisées de la réponse immunitaire, comme moyen d’exploration de l’immunodépression du patient en sepsis sévère et de la personne âgée infectée, à risque d’infections nosocomiales. Résultats : Nous avons identifié des signatures spécifiques chez les cellules mononucléées stimulées in vitro par des agonistes M1, des cytokines M2 ou différentes bactéries. La comparaison de spectres de patients en sepsis sévère avec ou sans documentation microbiologique avec les spectres des PBMCs stimulés in vitro a ensuite mis en évidence chez tous les patients une signature spectrale de type Interleukine IL-10 et Interféron IFN- ainsi qu’une signature spectrale oligodésoxynucléotides CPG (CpG ODN) suggérant une étiologie bactérienne. L’évaluation in vitro de la formation de granulomes a permis de mettre en évidence un défaut de formation de granulomes chez les patients septiques quel que soient leur âge. Pour expliquer ce défaut, les patients en sepsis sévère ne formant pas de granulome présentaient des numérations de monocytes et de lymphocytes diminuées. Chez la personne âgée, une dénutrition était retrouvée chez les patients ne formant pas de granulome. Un déficit en TNF sans augmentation de l’IL-10 associé à un défaut de différenciation des macrophages en cellules épithélioides et en cellules géantes multinucléées sont retrouvés en cas de défaut de formation de granulomes. Discussion La spectrométrie de masse MALDI-TOF par son approche de caractérisation cellulaire par « profiling » à partir de l’analyse directe des cellules entières présente de nombreux avantages car elle requiert très peu de préparation des échantillons cellulaires et aucune extraction ou séparation préalable des biomolécules. Elle est extrêmement sensible et reproductible. Malgré les limites de nos travaux, la spectrométrie de masse pourrait permettre de distinguer un SIRS en lien avec une pathologie inflammatoire ou infectieuse ou encore d’aider le clinicien dans un contexte de SIRS non infectieux à dépister l’apparition d’une complication infectieuse avant même la clinique et l’identification d’un micro-organisme sur des prélèvements. La mesure de la formation in vitro de granulomes pourrait quant à elle permettre d’évaluer le degré d’immunosuppression et servir à monitorer la réponse immune en réponse à un traitement. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les différents mécanismes impliqués dans le défaut de formation des cellules géantes multinucléées. Conclusion : La réponse de l’hôte à l’infection est complexe. Son exploration nécessite des approches combinées afin de permettre une personnalisation des thérapeutiques dans le cadre du suivi des patients.

Introduction: Sepsis is a major cause of mortality in both outpatient medicine and hospitals, especially in the geriatric population. Early diagnosis and identification of the severity of the picture are crucial to ensuring swift and optimal management, which is synonymous with a better prognosis. However, the clinical reality is that it is often hard to confirm the infectious nature of the systemic inflammatory response syndrome observed and that, despite advances in microbiological techniques, up to 40% of infections are not documented. Patients and methods: We used MALDI-TOF mass spectrometry, a routine method for the identification of microorganisms, to identify a specific response profile of PBMCs to infectious aggression. This approach could be used to help clinicians determine patient treatment even before microbiological identification. We also investigated the in vitro formation of granulomas–organized structures formed as an immune response–to explore immunodepression in patients with severe sepsis and infected elderly subjects susceptible to nosocomial infections. Results: We identified specific signatures in monocytes stimulated in vitro by M1 agonists, M2 cytokines or various bacteria. The comparison of the spectra of patients with severe sepsis (with or without microbiological evaluation) with the spectra of PBMCs stimulated in vitro highlighted an Interleukin IL-10 and Interferon IFN--type spectral signature in all the patients as well as a CpG oligodeoxyribonucleotide (CpG-ODN) spectral signature, thus indicating a bacterial etiology. The assessment of granuloma formation in vitro highlighted the absence of granuloma formation in patients with sepsis regardless of their age. The lower monocyte and leukocyte counts in patients with severe sepsis not forming granulomas could explain this defect. In elderly subjects, malnutrition was observed in patients not forming granulomas. A TNF deficiency without an increase in IL-10 associated with defective differentiation of macrophages into epithelioid cells and multinuclear giant cells was observed in cases of defective granuloma formation. Discussion The direct analysis of whole cells using MALDI-TOF mass spectrometry profiling offers numerous advantages as it requires very little sample preparation and no prior extraction or separation of the biomolecules. Furthermore, this technique is extremely sensitive and reproducible. Despite the limitations of our research, mass spectrometry could help distinguish SIRS associated with an inflammatory or infectious condition or even help the clinician in cases of non-infectious SIRS to detect the onset of an infectious complication even before the appearance of any clinical signs or the identification of the microorganism. The assessment of granuloma formation in vitro could be used to determine the degree of immunosuppression and to monitor the immune response to therapy. Further studies are necessary to understand the different mechanisms involved in the defective formation of multinuclear giant cells. Conclusion: The host response to infection is complex and its exploration requires the use of combined methods to personalize therapy within the context of patient follow-up.