Soutenance de thèse de Solène MOULIN

Les hydrocarbures (HCs) de type alcanes et alcènes occupent une place prédominante dans notre économie actuelle. Ce sont les composants principaux des carburants fossiles mais ils sont aussi largement utilisés en tant que lubrifiants, ou comme émollients dans les cosmétiques. Les alcènes sont le point de départ de nombreuses synthèses organiques et donc communément exploités en chimie. Les HCs sont quasi-exclusivement issus de l’exploitation des ressources fossiles et les problématiques de changement climatique et d’épuisement des ressources poussent les recherches vers l’étude et la domestication des voies de synthèse naturelles d’HC. Les enzymes impliquées dans la biosynthèse des HCs à partir des acides gras sont ont été découvertes chez les plantes, les insectes et plusieurs espèces de bactéries ; elles appartiennent toutes à des familles de protéines distinctes. Lorsque ma thèse a commencé, une enzyme de biosynthèse d’HC, l’acide gras photodécarboxylase (Fatty Acid Photodecarboxylase, FAP) venait d’être découverte chez la microalgue verte Chlorella variabilis NC64A. Cette enzyme est une flavoprotéine de la famille des glucose-méthanol-choline (GMC) oxidoréductases et il avait été montré qu’elle permet la photo-décarboxylation d’un acide gras libre en un alcane ou alcène. Dans mes travaux, j’ai tout d’abord caractérisé chez la microalgue modèle Chlamydomonas reinhardtii l’homologue de la FAP de Chlorella,. Une étude plus large des homologues de la FAP de Chlorella a ensuite été menée en utilisant une approche de phylogénie molléculaire basée sur les génomes des espèces modèles séquencées ainsi que sur des données issues des expéditions TARA Océans. Cette étude a donné accès à un large réservoir naturel de variants potentiels de la FAP, dont certains pourraient être intéressants d’un point de vue biotechnologique. Elle a aussi permis de montrer que la FAP semblait être présente dans la plupart des algues malgré leur caractère polyphylétique. La FAP aurait donc été conservée lors des différents événements d’endosymbioses. Cela suggère fortement que les HCs générés par la FAP jouent un rôle important dans les fonctions chloroplastiques. Le rôle des HCs chez les algues a ensuite été étudié par une approche de génétique inverse chez Chlamydomonas reinhardtii. Des mutants knockout pour la FAP, montrant une absence totale d’HC, ont été isolés de la banque publique CLiP (Chlamydomonas Library Project). La caractérisation physiologique de ces mutants et de leurs complémentants n’a cependant pas permis de révéler un phénotype dans les conditions de culture testées. Des modifications physiologiques transitoires n’affectant pas la croissance ont pu être mises en évidence laissant penser qu’il existe des mécanismes de compensation à l’absence d’HCs. Dans une dernière partie, j’ai développé à l’échelle du laboratoire une plateforme de production d’HC basée sur une souche d’E. coli co-exprimant la FAP de Chlorella et une thioestérase spécifique des acides gras à chaînes moyennes. Cette souche cultivée à la lumière a permis une production continue d’HCs à chaînes longue et à chaînes moyennes pendant plusieurs jours dans la phase gaz des cultures. L’avancée majeure de cette étude réside dans le fait qu’une production gazeuse permet une récolte facilitée du produit d’intérêt sous forme pure. Cette étude constitue une preuve de concept prometteuse que la FAP pourrait être utilisée pour la production biosourcée d’HCs.

Alkane and alkene-type hydrocarbons (HCs) are predominant in our current economy. They are the main components of fossil fuels but are also widely used as lubricants or emollients in cosmetics. Alkenes are the starting point for many organic syntheses and therefore commonly used in chemistry. HCs are almost exclusively derived from the exploitation of fossil resources and today’s concerns about climate change and resource depletion are pushing research towards the study and domestication of natural HC synthesis pathways. The enzymes involved in the biosynthesis of HCs from fatty acids have been discovered in plants, insects and several species of bacteria; they all belong to distinct protein families. When my thesis began, a HC biosynthesis enzyme, Fatty Acid Photodecarboxylase (FAP) had just been discovered in the green microalgae Chlorella variabilis NC64A. This enzyme is a flavoprotein of the glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductase family and has been shown to allow the photodecarboxylation of a free fatty acid into an alkane or alkene. In my work, I first characterized in the model microalgae, Chlamydomonas reinhardtii the homologue of the FAP of Chlorella. A broader study of homologues of the FAP of Chlorella was then conducted using a molecular phylogeny approach based on the genomes of sequenced model species as well as data from TARA Ocean expeditions. This study provided access to a large natural reservoir of potential FAP variants, some of which may be of interest from a biotechnological point of view. It also showed that FAP appeared to be present in most algae despite their polyphyletic nature. The FAP would therefore have been conserved during the various endosymbiosis events. This strongly suggests that HCs generated by the FAP play an important role in chloroplastic functions. The role of HCs in algae was then studied by a reverse genetic approach in Chlamydomonas reinhardtii. Knockout mutants for FAP, showing a total absence of HCs, have been isolated from the public bank CLiP (Chlamydomonas Library Project). However, the physiological characterization of these mutants and their complementants did not reveal a phenotype under the conditions of culture tested. Transient physiological changes that do not affect growth have been identified, suggesting that there are mechanisms to compensate for the absence of HCs. In a final part, I developed a laboratory scale HC production platform based on an E. coli strain co-expressing the Chlorella FAP and a thioesterase specific for medium chain fatty acids. This strain, cultivated under light, allowed continuous production of long- and medium-chain HCs for several days in the gas phase of the cultures. The major progress of this study lies in the fact that gas production allows an easier harvesting of the product of interest in pure form. This study is a promising proof of concept that FAP could be used for biosourced HC production.