Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé: Biochimie structurale

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

Scribble,phosphorylation,TEM,morphogenèse épithéliale,

Keywords

Scribble,phosphorylation,EMT,epithelial morphogenesis,

Titre de thèse

Identification et caractérisation fonctionnelle d'un nouveau site de phosphorylation de Scribble
Identification and functional characterization of a novel Scribble phosphorylation site

Date

Mercredi 3 Juillet 2019 à 14:00

Adresse

Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille 27 bd Leï Roure BP 30059 13273 MARSEILLE CEDEX 09 FRANCE IPC2

Jury

Directeur de these M. Jean-paul BORG Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
Rapporteur Mme Nathalie SANS INSERM ADR Nouvelle Aquitaine
Examinateur M. Michel AURRAND-LIONS Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
Rapporteur M. Frédéric LUTON Institut de Phamacologie Moléculaire et Cellulaire, Université Côte d'Azur, CNRS UMR7275

Résumé de la thèse

Scribble est une protéine d’échafaudage cytoplasmique jouant un rôle-clé dans la polarité cellulaire. Cette protéine contient 16 répétitions riches en leucine (LRR) du côté N-terminal suivies par quatre domaines PDZ. Elle se localise à la membrane plasmique en position basolatérale des cellules épithéliales de mammifères. Initialement identifiée chez la Drosophile, Scribble agit comme un suppresseur de tumeur. En condition homéostatique, le complexe Scribble est essentiel pour organiser les voies de signalisation intracellulaires qui maintiennent les polarités cellulaires apico-basale et planaire. En contexte pathologique tel que le cancer, la dérégulation des fonctions de Scribble conduit à des défauts de polarité cellulaire médiés par de multiples mécanismes de signalisation. Nous avons choisi de centrer notre étude sur le rôle de Scribble au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), un événement courant dans les tumeurs agressives, et d'étudier la dynamique des modifications post-traductionnelles de Scribble au cours de ce processus. Comme modèle d’étude, nous avons utilisé la lignée de cellule rénale canine MDCK (Madin-Darby Canine Kidney), un système cellulaire bien établi pour étudier la transition épithélio-mésenchymateuse induite par le TGFβ. Dans ce contexte, nous avons pu identifier plusieurs modifications post-traductionnelles de Scribble après purification et analyse par spectrométrie de masse de la protéine. Nous avons établi que Scribble est phosphorylée sur la Sérine 1220 et que cette phosphorylation est modulée négativement en réponse au TGFβ. Nous avons confirmé ces résultats dans une autre lignée de cellules épithéliales (NMuMG), en utilisant un anticorps spécifique de la Sérine 1220 phosphorylée. La mutation de la Sérine 1220 en alanine entraîne une délocalisation partielle de Scribble de la membrane plasmique et un léger retard dans la formation des jonctions serrées. Pour examiner la pertinence fonctionnelle de cet événement, nous avons utilisé un système de culture de cellules épithéliales tridimensionnel et avons démontré que l'expression du mutant phospho-déficient S1220A de Scribble altère de façon importante la cystogenèse. L’ensemble de ces données caractérise une nouvelle modification post-traductionnelle de Scribble importante pour la morphogenèse épithéliale.

Thesis resume

Scribble is a large cytoplasmic scaffold protein that plays a key role in cell polarity. It contains 16 amino-terminal leucine-rich repeats (LRRs) and four carboxy-terminal PDZ domains and is localized at the basolateral membranes of mammalian epithelial cells. Scribble was first identified and characterized as a neoplastic tumor suppressor in Drosophila. In homeostatic conditions, the Scribble complex is essential to organize intracellular signaling pathways that maintain apico-basal and planar cell polarities. In pathological conditions such as cancer, deregulation of Scribble functions leads to cell polarity defects through multiple signaling mechanisms. We chose to focus our study on the role of Scribble during epithelial-mesenchymal transition (EMT), a common event in aggressive tumors, and to investigate the dynamics of Scribble post-translational modifications during this process. As a model, we used Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells, a well-accepted cell system to study EMT induced by TGFβ. Upon EMT induction, we identified Scribble post-translational modifications after Scribble purification and mass spectrometry analysis. We identified that Scribble is phosphorylated at Ser1220 and that this phosphorylation event is negatively modulated by TGFβ stimulation. We confirmed these results using a specific antibody against the phosphorylation site of Scribble in another epithelial cell line (NMuMG). Mutation of the Scribble phosphorylation site in alanine resulted in its partial mislocalization from the plasma membrane to the cytoplasm and led to a delay in the formation of tight junctions. To examine the functional relevance of this event, we used a three-dimensional epithelial cell culture system and demonstrated that expression of the phospho-deficient Scribble mutant severely altered cystogenesis. Together these data characterize a novel Scribble post-translational modification important for epithelial morphogenesis.