Soutenance de thèse de GADACHA Jihane
Titre de thèse
Identification et étude des mécanismes physiopathologiques d'une nouvelle forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à des mutations du gène KCTD11
Identification and characterization of the pathophysiological mechanisms of a novel form of Charcot-Marie-Tooth disease associated with mutations in the KCTD11 gene
Résumé de la thèse
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la plus fréquente des neuropathies neuromusculaires héréditaires, avec une prévalence estimée à 1 sur 2 500. Cliniquement, la CMT se manifeste par une atrophie et une faiblesse musculaire distale, des déformations des pieds et des mains, accompagnées de troubles sensitifs. Elle résulte d'une dégénérescence progressive des fibres nerveuses du système nerveux périphérique (SNP), touchant préférentiellement les régions distales. Cette pathologie se caractérise par une hétérogénéité clinique et génétique, avec plus de 125 gènes identifiés à ce jour. Dans ce contexte, notre groupe a identifié KCTD11 comme gène candidat dans quatre familles atteintes d'une forme intermédiaire autosomique récessive de CMT, portant des variants bi-alléliques prédits pour entraîner une perte de fonction. KCTD11 code pour la protéine KCTD11/REN, dont la fonction dans le SNP n'a jamais été étudiée, bien qu'elle interagisse avec les protéines HDAC1 et β-caténine ainsi que le complexe mTORC1, trois régulateurs clés dans le SNP.
Ainsi, l'objectif de ma thèse est de démontrer que le gène KCTD11 est bien en cause dans cette forme de CMT. Dans ce but, j'ai organisé mes recherches en trois axes : dans un premier temps en (i) évaluant l'effet fonctionnel des variants, en (ii) étudiant l'impact de la perte constitutive de Kctd11 sur le nerf périphérique, et enfin en (iii) explorant les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la pathologie. Afin d'évaluer les effets fonctionnels des variants, j'ai surexprimé les formes sauvage et mutées de KCTD11 dans une lignée de cellules HEK293. Pour explorer le rôle de KCTD11 dans le SNP et reproduire le déficit créé chez les patients, j'ai utilisé un modèle de souris Kctd11-/- à invalidation constitutionnelle, ainsi qu'un modèle de coculture de neurones sensitifs et de cellules de Schwann (DRGN/SC) dérivé du modèle in vivo.
La caractérisation fonctionnelle des variants a révélé que leur présence entraîne une diminution drastique des niveaux de KCTD11, en induisant une dégradation accrue de la protéine par autophagie. In vitro, dans le modèle DRGN/SC, j'ai observé une altération de la dynamique de myélinisation qui se manifeste par une réduction du nombre d'internœuds aux jours 14 et 18, suivie d'une augmentation de leur nombre au jour 22 en condition Kctd11-/- par rapport à la condition sauvage. Ces perturbations s'accompagnent de dérégulations de l'expression de facteurs de transcription clés de la myélinisation, tels que Egr2 et Sox10, ainsi que d'autres gènes liés à la myéline, comme le montre l'analyse transcriptomique réalisée. In vivo, la perte de KCTD11 induit une myélinisation anormale dans les nerfs périphériques de souris âgées avec la présence d'anomalies de la myéline, des signes de dégradation ainsi qu'une réduction de l'épaisseur de la gaine de myéline. Sur le plan axonal, seul un élargissement tardif du diamètre des axones a été observé dans le nerf distal. L'exploration des mécanismes physiopathologiques en cause a mis en évidence une dérégulation de l'expression de HDAC1, ainsi qu'une perturbation de l'activité de la voie Wnt/β-caténine, liée à une perturbation de la phosphorylation de β-caténine. L'analyse transcriptomique du nerf périphérique à un stade tardif révèle que la perte de KCTD11 déclenche un remodelage transcriptionnel. Celui-ci se traduit d'abord par la dérégulation de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et la balance prolifération/différenciation, et faisant intervenir dans un second temps des processus inflammatoires et l'activation de gènes régulateurs de l'épigénétique.
Pour conclure, mes travaux identifient KCTD11 comme un nouveau gène responsable d'une forme intermédiaire autosomique récessive de CMT. Ils mettent en lumière un rôle clé de KCTD11 dans le SNP : assurer l'homéostasie de la myéline par la régulation des niveaux de HDAC1 et de la phosphorylation de β-caténine, afin de prévenir les anomalies tardives de la myéline.
Thesis resume
Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is the most common inherited neuromuscular disorder, with an overall prevalence of 1 in 2,500. It is clinically and genetically heterogeneous, with over 125 disease-causing genes identified to date. This pathology is characterized by progressive, length-dependent degeneration of peripheral nerves, especially in distal regions, which results in clinical features including distal muscle atrophy and weakness, foot and hand deformities, and sensory deficits. Our team identified four unrelated families with an intermediate autosomal recessive form of CMT with bi-allelic variants in the KCTD11 gene. Given their predicted loss-of-function effects, these variants were selected as strong candidates for the genetic cause of the disease. The KCTD11 gene has never been associated with hereditary neuropathies. However, it encodes the KCTD11/REN protein, whose function in the peripheral nervous system (PNS) remains largely unexplored, although it regulates HDAC1, β-catenin, and mTORC1, key regulators of myelination and neuronal differentiation in the PNS.
Thus, the aim of my PhD is to demonstrate that KCTD11 is the defective gene in this form of CMT. To address this, I have organized my research into three parts: I first have (i) demonstrated the pathogenicity of the identified variants with functional studies, (ii) studied the impact of KCTD11 loss on the peripheral nerve physiology, and finally (iii) explored the underlying pathophysiological mechanisms. Accordingly, the functional effects of the variants were investigated by overexpressing wild-type and mutant forms of human KCTD11 in HEK293 cells. To explore KCTD11's role in the PNS, I used a constitutive Kctd11-/- mouse model and the derived in vitro myelin model of sensory neuron and Schwann cell co-culture (DRGN/SC), to mimic the loss-of-function induced by patient mutations.
First, by overexpressing KCTD11 mutant forms in HEK293 cells, I demonstrated their loss-of-function effect, by causing enhanced degradation of the protein via autophagy. Subsequently, in DRGN/SC co-cultures, I observed an alteration in the temporal myelination dynamics, characterized by a reduced number of internodes at day 14 and day 18, followed by an increased number at day 22 in the Kctd11-/- condition compared to wild-type. These defects were associated with dysregulation of the expression of key transcription factors in Schwann cells, such as Egr2 and Sox10, along with other myelin-related genes, as revealed by mRNA-sequencing data. In the mice, the absence of Kctd11 led in peripheral nerves of aged mice to abnormal myelination, with features including structural abnormalities, signs of myelin degradation, and a reduction in myelin sheath thickness. At the axonal level, I observed a late enlargement of the axonal diameter in the distal tibial nerve. Regarding pathophysiological mechanisms, I identified dysregulation of HDAC1 expression, as well as alterations in the Wnt/β-catenin pathway, via changes in β-catenin phosphorylation. Transcriptomic analysis of the tibial nerve at a late stage reveals that the loss of KCTD11 initiates a transcriptional remodeling process, characterized by dysregulation of genes involved in the cell cycle and the proliferation/differentiation balance, followed by secondary mechanisms involving inflammation and the activation of epigenetic regulatory genes.
Altogether, my results identify KCTD11 as a novel gene defective in autosomal recessive intermediate CMT. The results highlight the key role of KCTD11 in maintaining myelin homeostasis through regulation of HDAC1 and phosphorylated β-catenin levels, thereby preventing late-onset myelin abnormalities and degradation.