Soutenance de thèse de Romain AVELLAN

Une des principales caractéristiques des mycobactéries, est leur capacité à importer et à retraiter les acides gras libres dérivés de l'hôte, stockés sous forme de triacylglycérols (TAG) sous la forme d'Inclusions Lipidiques Intrabactériennes (ILI). Ces ILI servent de source de carbone et d'énergie pour la survie de la bactérie, impliquant donc la présence d’enzymes mycobactériennes responsables de leur synthèse et de leur hydrolyse ; enzymes dont la plupart possèdent une sérine ou une cystéine catalytique dans leur site actif : i.e., (Ser/Cys)-enzymes. Dans ce contexte, nous avons utilisé deux familles d’inhibiteurs, les CyCs et les OXs, comme outils pour le diagnostic des infections mycobactériennes et comme sondes pour décrypter le métabolisme des lipides chez M. abscessus (M. abs) et M. tuberculosis (M. tb). En utilisant des approches de chemobiologie, nous avons réalisé la capture directe des enzymes inhibées par nos CyCs et OXs à partir d'une culture de M. tb. Parmi la variété d’enzymes identifiées, majoritairement impliquées dans le métabolisme des lipides ou des stérols, nous avons caractérisé biochimiquement et structurellement HsaD (Rv3569c), protéine impliquée dans le métabolisme du cholestérol et annotée comme essentielle pour la survie de M. tb dans les macrophages. Cette approche de CC-ABPP a ensuite été appliquée sur des cultures de M. abs dans des conditions mimant l’accumulation des ILI. Les données de protéomique obtenues ont été soumises à une analyse statistique conduisant à une liste de 65 enzymes potentiellement impliquées dans le métabolisme des lipides ou des acides gras chez M. abs. La construction de mutant de délétion, complémentation et de surexpression, nous a permis de valider que MAB_1978c (FadD15), une acyl-CoA ligase, était directement impliquée dans la biogénèse de ces ILI chez M. abs. Mot clefs : Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium abscessus, Oxadiazolone, Cyclophostine/Cyclipostins, Métabolisme des lipides, Chemobiologie, Chimie click, Inclusions lipidiques Intrabactériennes

One of the main characteristics of mycobacteria is their ability to import and process host-derived free fatty acids, which are then stored as triacylglycerols (TAGs) in their own cytoplasm in the form of Intrabacterial Lipid Inclusions (ILI), which serve as a source of carbon and energy for the bacterium's survival. This property underscores the essential role of lipid metabolism in the survival and long-term persistence of mycobacteria and, consequently, of the mycobacterial enzymes responsible for the synthesis and hydrolysis of these mycobacterial lipids. Most of these enzymes have a catalytic serine or cysteine in their catalytic sites: i.e., (Ser/Cys) enzymes. In this context, we used two families of inhibitors, the CyCs and the OXs, as tools for the diagnosis of mycobacterial infections and as probes for deciphering lipid metabolism in M. abscessus (M. abs) and M. tuberculosis (M. tb). Using chemobiological approaches (click-chemistry activity-based protein profiling, CC-ABPP), we were able to directly capture enzymes inhibited by our CyCs and OXs from a M. tb culture. Among the enzymes identified, mostly involved in lipid or sterol metabolism, we biochemically and structurally characterized HsaD (Rv3569c), a protein involved in cholesterol metabolism and annotated as essential for M. tb survival in macrophages. This CC-ABPP approach was further applied to M. abs cultures under conditions mimicking ILI accumulation. The proteomic data obtained were subjected to statistical analysis, resulting in a setlist of 65 enzymes potentially involved in lipid or fatty acid metabolism in M. abs. The construction of deletion, complementation and overexpression mutants allowed us to validate that MAB_1978c (FadD15), a long-chain-fatty-acid--CoA ligase, is directly involved in the biogenesis of these ILI in M. abs. Keywords: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium abscessus, Oxadiazolone, Cyclophostin/Cyclipostins, Lipid metabolism, Chemobiology, Click-chemistry, Intrabacterial Lipid Inclusions.