Soutenance de thèse de Carla SILVA MARTINS

Les septines sont des protéines cytosquelettiques conservées qui jouent un rôle central dans la division et la migration cellulaires. Elles sont présentes dans divers organismes, des algues et des protistes aux mammifères. Une caractéristique clé des septines est leur organisation en protomères palindromiques, hexamères et octamères, qui peuvent se polymériser en filaments, in vitro, et lier les filaments d'actine. Bien que le dysfonctionnement des septines humaines soit lié à l'infertilité, aux maladies neurodégénératives et à de multiples types de cancer, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la fonction des septines humaines sont mal compris. Nous supposons que la polymérisation des septines est essentielle à la fonction des septines dans les cellules de mammifères. Ma thèse de doctorat vise à tester cette hypothèse en déchiffrant comment les septines sont organisées dans les cellules de mammifères et à élucider comment l'organisation des septines est liée à leur fonction. Dans le but de développer des essais biomimétiques pour étudier la polymérisation et l'organisation des septines, j'ai contribué à la caractérisation biochimique de complexes de septines humaines recombinantes. Des essais de reconstitution utilisant ces complexes ont montré que les septines humaines ont la capacité de s'assembler en filaments in vitro. Pour permettre l'étude des septines dans des cellules vivantes, j'ai créé des fusions fonctionnelles de protéines fluorescentes de septines exprimées de manière ubiquitaire dans des cellules humaines. En utilisant ces fusions, j'ai montré que les septines s'associent largement aux fibres contractiles d'actine. Afin d'étudier l'assemblage des septines dans les cellules, j'ai conçu un test de complémentation tripartite split-GFP pour surveiller les interactions protéine-protéine aux extrémités des protomères, détectant ainsi la polymérisation des septines in situ dans les cellules vivantes. Mes résultats ont fourni, pour la première fois, des preuves claires de l'assemblage des filaments de septine dans les cellules et ont exclu davantage la coexistence des septines en tant que protomères. L'examen des filaments de septine dans des conditions (i) d'absence d'octamères ou (ii) d'absence d'hexamères a démontré que les filaments de septine sont principalement composés d'octamères. Des mesures de distance à résolution nanométrique ont montré que les septines associées à l'actine sont liées à la membrane. Des essais de reconstitution sur des bicouches lipidiques supportées ont en outre montré que les filaments de septine assurent la médiation de l'ancrage de l'actine à la membrane, conformément aux mesures effectuées par microscopie à force atomique dans les cellules, qui montrent que la rigidité cellulaire nécessite la présence de filaments de septine contenant des octamères. Sur la base de ces résultats et de la microscopie à superrésolution des filaments de septine dans les cellules, nous proposons que l'organisation des septines en filaments est essentielle pour leur fonction de stabilisation de l'actine à la membrane cellulaire. En tant qu'approche complémentaire pour explorer la façon dont les septines et l'actine interagissent, j'ai passé au crible des rapporteurs à base de protéines fluorescentes codées génétiquement qui permettent des mesures quantitatives non invasives de l'organisation des filaments d'actine et des septines dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie à fluorescence à résolution de polarisation. Mes travaux ont contribué à une meilleure compréhension de l'organisation fonctionnelle des septines dans les cellules de mammifères, ce qui a permis de mieux comprendre le lien entre l'organisation des septines et les rôles qu'elles jouent dans les cellules.

Septins are conserved cytoskeletal proteins with a central role in cell division and cell migration. They are present in diverse organisms, from algae and protists to mammals. A key feature of septins is their organization into palindromic protomers, hexamers and octamers, which can polymerize into filaments, in vitro, and bind actin filaments. Although human septin dysfunction is linked to infertility, neurodegenerative diseases and multiple types of cancer, the molecular mechanisms underlying the function of human septins are poorly understood. We hypothesize that septin polymerization is essential for septin function in mammalian cells. My PhD thesis aims at testing this hypothesis by deciphering how septins are organized in mammalian cells and at elucidating how septin organization interplays with their function. In an effort to develop cell-free assays for studying septin polymerization and organization, I contributed to the biochemical characterization of recombinant human septin complexes. Reconstitution assays using such complexes showed that human septins have the capacity to assemble into filaments in vitro. To enable live cell studies of septins, I engineered functional fluorescent protein fusions of ubiquitously-expressed septins in human cells. Using these fusions, I showed that septins associate extensively with contractile actin-stress fibers. In order to address septin assembly in cells, I designed a tripartite split-GFP complementation assay to monitor protein-protein interactions at the protomer ends, thus detecting septin polymerization in situ in living cells. My results provided, for the first time, clear evidence of septin filament assembly in cells and further excluded the co-existence of septins as protomers. Examination of septin filaments under conditions of (i) absence of octamers or (ii) absence of hexamers demonstrated that septin filaments are primarily composed of octamers. Nanometer-resolved distance measurements showed that actin-associated septins are membrane-bound. Reconstitution assays on supported lipid bilayers further showed that septin filaments mediate actin-membrane anchoring, in line with atomic force microscopy measurements in cells showing that cell stiffness requires the presence of octamer-containing septin filaments. Based on these findings and on superresolution microscopy of septin filaments in cells, we propose that septin organization as filaments is essential for their function in stabilizing actin at the cell membrane. As a complementary approach to exploring how septins and actin interact, I screened genetically-encoded, fluorescent-protein-based reporters that allow non-invasive, quantitative measurements of actin filament and septin filament organization in living cells by using polarization-resolved fluorescence microscopy. My work contributed to a better understanding of how septins functionally organize in mammalian cells thus providing new insights into the link between septin organization and the reported roles of septins in cells.