Soutenance de thèse de FRANCIS SIMO FOUDA

Les techniques de méta-génomique et de séquençage haut débit ont révolutionné la découverte de nouveaux virus, parmi lesquels les parvovirus émergeant comme potentiels agents pathogènes. Au début de cette thèse, le Sud de l’Europe n’avait aucune donnée épidémiologique disponible ni sur la prévalence des nouveaux parvovirus (bufavirus, cutavirus, parvovirus 4) dans les échantillons de selles ni sur la variété des génotypes circulants. L’objectif de ce travail de thèse était d’établir les caractéristiques de ces nouveaux parvovirus chez les patients des hôpitaux du sud-est de la France et de développer des outils de génotypage de ces virus par des techniques de PCR en temps réel applicables en laboratoire de routine. L’amplification par PCR d’une portion du gène de la protéine NS1 du bufavirus a permis de déterminer la prévalence relativement élevée de ce virus (3,6%) dans les échantillons de selles des patients au Sud-Est de la France, et de confirmer la présence de l’ADN de ce virus dans des échantillons de sang. Une mortalité plus élevée a été constatée chez les patients ayant des selles positives au bufavirus (p=0.034) et les données obtenues montrent que ce virus pourrait établir une infection chronique ou un portage digestif. Les tests de PCR ciblant les cutavirus (gène de la VP2), les bocavirus (gènes NS1, NP1) et les parvovirus 4 (gène NS1) ont permis de constater des prévalences respectives à 0.7%, 0.3% et 0% dans les prélèvements de selles. Afin de mettre au point des outils de génotypage du bufavirus, toutes les séquences de la protéine structurale VP2 disponibles dans les banques de données publiques ont été collectées. Ces séquences correspondaient à des souches virales d’Europe (Finlande, Pays-Bas), d’Afrique (Burkina-Faso, Ethiopie, Tunisie) et d’Asie (Bhutan, Chine, Thaïlande, Turquie). Leur analyse bioinformatique a identifié des motifs nucléotidiques conservés permettant de concevoir trois systèmes de PCR en temps réel pouvant être utilisé en laboratoire de routine. En utilisant ces outils, nous avons pu montrer que le génotype 1 est prédominant dans la zone de l'étude sur la population étudiée (54/68 cas), suivi par le génotype 3 (11/68 cas) et le génotype 2 (3/68 cas). La même approche a été utilisée pour le génotypage des cutavirus à partir de séquences de la protéine VP de souches d’Europe (Allemagne, Danemark, France, Finlande), d’Afrique (Botswana) et d’Amérique du Sud (Brésil). Nous avons aussi évalué les performances du test immunochromatographique Ridaquick Rotavirus/Adenovirus® utilisé en routine au CHU de Marseille pour la détection rapide des rotavirus et des adénovirus dans les selles de patients prélevés pour gastro-entérite. Si les performances pour les rotavirus sont satisfaisantes, une sensibilité analytique de moins de 30% remet en cause son utilisation en routine. Les raisons de ces faibles performances ont étudiées et ont suggéré que l'utilisation d'un test moléculaire devait être recommandé. Ces données ont été comparées aux autres études de la littérature. Nous avons également rédigé une revue de la littérature présentant la distribution des divers agents pathogènes responsables des gastroentérites en France, avec comme source de données les rapports annuels de 7 Centres Nationaux de Référence (CNR) et les articles publiés dans la littérature.

Metagenomic and high-throughput sequencing techniques have revolutionized the discovery of new viruses, among which parvoviruses are emerging as potential pathogens. At the beginning of this thesis, Southern Europe had no epidemiological data available neither on the prevalence of new parvoviruses (bufavirus, cutavirus, parvovirus 4) in stool samples nor on the variety of circulating genotypes. The objective was to establish the characteristics of these new parvoviruses in patients from hospitals in the south-east of France and to develop tools for genotyping these viruses by real-time PCR techniques applicable in routine laboratories. PCR amplification of a portion of the bufavirus NS1 protein gene determined the relatively high prevalence of this virus (3.6%) in stool samples from patients in southeastern France, and confirmed the presence of this virus DNA in blood samples. Higher mortality was found in patients with bufavirus-positive stools (p=0.034), and the data obtained indicate that this virus could establish a chronic infection or long-term digestive carriage. PCR tests targeting cutaviruses (VP2 gene), bocaviruses (NS1, NP1 genes) and parvovirus 4 (NS1 gene) found respective prevalences of 0.7%, 0.3% and 0% in stool specimens. In order to develop bufavirus genotyping tools, all sequences of the VP2 structural protein available in public databases were collected. These sequences corresponded to viral strains from Europe (Finland, Netherlands), Africa (Burkina-Faso, Ethiopia, Tunisia) and Asia (Bhutan, China, Thailand, Turkey). Their bioinformatics analysis identified conserved nucleotide patterns allowing the design of three real-time PCR systems that can be used in routine laboratories. Using these tools, we were able to show that genotype 1 is predominant in the study area in the study population (54/68 cases), followed by genotype 3 (11/68 cases) and genotype 2 (3/68 cases). The same approach was used for cutavirus genotyping from VP protein sequences of strains from Europe (Germany, Denmark, France, Finland), Africa (Botswana) and South America (Brazil). We also evaluated the performance of the Ridaquick Rotavirus/Adenovirus® immunochromatographic test used routinely at the Marseille University Hospital for the rapid detection of rotavirus and adenovirus in the stools of patients sampled for gastroenteritis. If the performances for rotavirus are satisfactory, an analytical sensitivity of less than 30% calls into question its use in routine. The reasons for this low performance were studied and suggested that the use of a molecular test should be recommended. These data were compared with other studies in the literature. We also wrote a literature review presenting the distribution of the various pathogens responsible for gastroenteritis in France, using as data source the annual reports of 7 National Reference Centers (NRC) and articles published in the literature.