Soutenance de thèse de NGUYEN Phu
Titre de thèse
Caractérisation structurelle et fonctionnelle de GacS, l'histidine kinase membranaire contrôlant les modes d'infection de Pseudomonas aeruginosa, et développement de nouveaux nanobodies inhibiteurs.
Structural and functional characterization of GacS, the membrane-bound histidine kinase controlling infection modes in Pseudomonas aeruginosa, and development of novel inhibitory nanobodies.
Résumé de la thèse
Pseudomonas aeruginosa (PA), une bactérie pathogène opportuniste à Gram négatif, peut se développer dans une large gamme de conditions environnementales. Elle est responsable d'infections associées aux soins dans le monde entier et peut provoquer des infections potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés. La virulence de PA est associée à deux modes d'infection distincts : l'infection aiguë, caractérisée par un état planctonique hautement virulent pouvant se disséminer par la circulation sanguine, et l'infection chronique, caractérisée par la formation de biofilms, qui favorise la persistance bactérienne et rend l'infection difficile à éradiquer par le système immunitaire de l'hôte et les antibiotiques. PA possède de nombreux systèmes à deux composants (TCS, Two-Component Systems) : des complexes protéiques qui permettent à cette bactérie de passer d'un mode d'infection à l'autre en réponse aux changements environnementaux. Un TCS typique est composé d'une histidine kinase et de son régulateur de réponse cognat.
Le réseau de signalisation multi-kinases Gac/Rsm est un système de régulation clé qui contrôle le passage entre les deux modes d'infection chez PA. Le système GacS/GacA est au centre de ce réseau, et la transduction du signal par GacS dépend de communications croisées avec d'autres histidine kinases (HK) membranaires. En particulier, RetS est un antagoniste bien connu de la voie de signalisation GacS/GacA. Pour initier son autophosphorylation en trans, le récepteur GacS sous forme dimérique doit reconnaître un signal environnemental qui reste à ce jour inconnu. Cette étape est suivie d'une cascade de phosphorylation qui conduit finalement à l'activation du régulateur de réponse cognat GacA. GacS possède plusieurs domaines fonctionnels qui modulent les étapes successives de l'autophosphorylation et du transfert de phosphate. Plusieurs de ces domaines ont déjà été caractérisés sur les plans structural et fonctionnel ; cependant, l'architecture complète de GacS reste inconnue.
Cette thèse vise à déterminer la structure de la protéine GacS entière (Full-Length) et à développer de nouveaux nanocorps capables d'inhiber la cascade de phosphorylation de GacS tout en favorisant la stabilisation conformationnelle de cette protéine pour les études structurales. Une première reconstruction par microscopie électronique cryogénique (Cryo-EM) a permis d'obtenir une carte de densité de GacS à une résolution de 11,23 Å, bien que les deux domaines C-terminaux n'aient pas pu être modélisés, probablement en raison de leur forte flexibilité. Une analyse plus approfondie des données de Cryo-EM a révélé plusieurs mouvements conformationnels intrinsèques au sein de la région cytoplasmique de GacS. Ceux-ci sont probablement liés aux mouvements segmentaires impliqués dans la transduction du signal et pourraient également contribuer à la résolution limitée de la carte reconstruite. De plus, deux nanocorps ont été identifiés comme se liant au cœur catalytique de GacS (domaine H1) et inhibant son activité kinase. Des résultats complémentaires soutiennent également l'existence d'états oligomériques de GacS d'ordre supérieur, en plus du dimère natif précédemment établi. Enfin, plusieurs résultats suggèrent que l'interaction avec RetS ne perturbe pas l'organisation dimérique de GacS.
Thesis resume
Pseudomonas aeruginosa (PA), a Gram-negative opportunistic pathogen can thrive in a wide range of environmental conditions. It is responsible for healthcare-associated infections worldwide and can cause life-threatening infections in immunocompromised patients. PA virulence is associated to two distinct infection modes: the acute infection, characterized by a highly virulent planktonic state that can disseminate through blood stream, and chronic infection, characterized by biofilm formation, which promotes bacterial persistence and makes the infection difficult to eradicate by host immune system and antibiotics. PA contains numerous Two Component Systems (TCS): protein complexes which enable this bacterium to switch between these two infection modes in response to environmental changes. A typical TCS is composed of a histidine kinase and its cognate response regulator.
The Gac/Rsm multi-kinase signaling network is a key regulatory system that modulates the switch between the two infection modes in PA. GacS/GacA TCS is at the center of this network and GacS signal transduction depends on crosstalks with others membrane-bound histidine kinases (HKs). In particular, RetS is a well-known antagonist of GacS/GacA signaling pathway. To initiate trans-autophosphorylation, the GacS dimeric sensor has to recognize an as-yet unknown environmental signal. This is followed by a phosphorylation cascade that consequently leads to the activation of the cognate response regulator GacA. GacS possesses multiple functional domains modulating the successive steps of autophosphorylation and phosphotransfer. Several domains have already been structurally and functionally characterized, however, the overall complete architecture of GacS remains unknown.
This thesis aims to determine the structure of GacS Full-Length protein and develop novel nanobodies capable of inhibiting the phosphorylation cascade of GacS while promoting the conformational stabilization of this protein for structural studies. An initial Cryogenic-Electron Microscope (Cryo-EM) reconstruction resulted in a density map of GacS at a resolution of 11.23 Å, although the two C-terminal domains remained unmodeled, presumably due to their high flexibility. Further analysis of the Cryo-EM data revealed several intrinsic conformational movements within the cytoplasmic region of GacS, which are presumably linked to the segmental movements involved in signal transduction, and may also contribute to the limited resolution of the reconstructed map. In addition, two nanobodies were identified that bind to the catalytic core of GacS (H1 domain), and inhibit its kinase activity. Complementary results also support the existence of higher-order GacS oligomeric states in addition to the previously established native dimer. Finally, several results also suggest that the interaction with RetS does not disrupt the dimeric organization of GacS.